هذا البروتوكول يفسر تصنيع الميكروبات، والتي سيتم استخدامها للمساعدة في السيطرة على معدل الإفراج ومقدار اميلويد الذي هو بروتين الفائدة. ستقوم الميكروبات بشل الخلايا في مادّة حيويّة مناسبة، وستُؤويها من بيئتها المحيطة، فضلاً عن السماح لها بتبادل المنتجات الثانوية والمواد المغذية مع بيئتها المحيطة. التغليف الخلايا باستخدام هذه التقنية يضمن تحكماً محكماً في حجم الميكروبات وكذلك رقم الخلية، ونحن نفعل ذلك عن طريق ضبط مختلف المعلمات التصنيع.
حتى تغليف الخلايا الموصوفة في هذا البروتوكول سوف تعطينا أكثر من إطلاق مزمن من اميلويد لاستخدامها في كل من في المختبر وفي نظم الجسم الحي، والفكرة ستكون هذه من شأنه أن يعطينا فهما أفضل لآليات المرض، وأيضا تسمح لنا لاختبار علاجات جديدة. يمكن استخدام هذه الطريقة لصياغة نظام تسيطر عليها ودراسة إطلاق أي الجزيئات الحيوية لأنواع كثيرة من الخلايا، سواء وحدها أو مجتمعة. للبدء، إزالة قارورة شبه ملتحمة من الحاضنة.
علاج الخلايا مع 0.25٪ تريبسين-EDTA حل واحتضان في 37 C لمدة خمس إلى 10 دقائق لفصل الخلايا. بعد إضافة DMEM/F12 المتوسطة، وجمع الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر. الطرد المركزي الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.
إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه في محلول ملحي احتياطي HEPES لمضاعفة تركيز الخلية المطلوب النهائي. في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، مزيج هذا التعليق الخلية في نسبة واحد إلى واحد مع 4٪ الوزن وحجم حل alginate للحصول على تعليق النهائي الذي يحتوي على التركيز المطلوب الخلية في 2٪ من الوزن وحجم الحل alginate. لتعيين معلمات التغليف، قم بتعيين سرعة آلة التغليف إلى أقصى سرعة بثق، ثم قم بتعيين الجهد والتردد.
لتصنيع الميكروبات، في حقنة 20 ملليلتر، تحميل خمسة ملليلتر من تعليق الخلية alginate وربط حقنة إلى التغليف. لبدء التغليف، وتفعيل تدفق التي سوف تدفع تعليق الخلية alginate من خلال وحدة التغذية، وسوف يكون مقذوف تيار من قطرات من خلال فوهة. جمع أول ملليلتر واحد في النفايات منقار لتجنب تيار الأولية غير موحدة.
ثم الاستمرار في تشغيل المليلترات الأربعة المتبقية مما يسمح قطرات لتقع في حمام هلام كلوريد الكالسيوم. عند ملامسة حمام الجلات ، فإن alginate في القطرات عبر الروابط على الفور مع أيونات الكالسيوم في حمام الجلات ، وتشكيل الميكروبات الكروية. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة منقار الجلاة من المنصة المغناطيسية والسماح للميكروبات بالراحة لمدة أربع دقائق أخرى دون تحريض لإكمال هلامها في درجة حرارة الغرفة.
لاسترداد الميكروبات، استخدم أولا زوج من ملاقط معقمة لإزالة أي حطام ألموس كبير أو التحف. بعد قطع نهاية ماصة بلاستيكية، واستخدامها لنقل الميكروبات من حمام هلام إلى مرشح شبكة 74 ميكرومتر عقد على منقار النفايات. لضمان النجاح، نحن دائما قطع نهاية ماصة بلاستيكية لتجنب إتلاف الميكروبات ونحن نفعل ذلك في كل مرة ننقل الخرز من وعاء إلى آخر بعد التغليف.
عكس مرشح شبكة عبر أنبوب الطرد المركزي. الماصات وسيلة الثقافة المناسبة أكثر من ذلك لغسل الخرز أسفل الأنبوب والسماح لهم لتكواسير في هذا المتوسط لمدة خمس دقائق. ثم نقلها إلى قارورة كانت معبأة سابقًا بالوسط المناسب للحضانة والمزيد من التجارب.
لتقييم صلاحية الخلية بعد التغليف والثقافة ، أضف مزيج حل لتعطيل الميكروبات بلطف وإطلاق الخلايا المغلفة. احتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية تكملها 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 C لمدة 10 دقائق مع التحريض اللطيف. تقدير صلاحية الخلايا لهذه الخلايا عن طريق تلطيخها باللون الأزرق trypan واستخدام غرفة قياس الهيموسيت.
لتقييم استقرار الميكروبات، قم بقياس متوسط قطر العينة من كل مجموعة ميكروباتية على مدار دورة زمنية باستخدام المجهر وبرامج التصوير. بعد التحضير ، تم إنشاء ميكروبات alginate الموحدة وال كروية بنجاح باستخدام هذا البروتوكول. بعد يوم واحد في ظروف ثقافة الخلايا القياسية، تم توزيع الخلايا المغلفة 7PA2 بالتساوي في الميكروبات.
عندما تم اختبار انتشار الخلايا 7PA2 باستخدام مقايسة MTS ، لم يكن هناك فرق كبير بين سلوك خلايا 7PA2 التي نمت مع أو بدون alginate على مدى فترة سبعة أيام. كشفت وسائل الإعلام المُكيفة التي تم تحليلها من الثقافات 2D و 3D لخلايا 7PA2 عن زيادة مستمرة في مستويات اميلويد بيتا 1-42 في كلتا الثقافتين. معدل إطلاق اميلويد بيتا 1-42 من الميكروبات، أو الثقافة 3D، هو مماثل في الملف الشخصي لتلك التي صدرت من ثقافة 2D.
يمكن استخدام خلايا 7PA2 المغلفة في الميكروبات الجينات بشكل فعال لإطلاق سراح مستمر من اميلويد بيتا. يجب أن تكون الميكروبات لengraftment في دماغ الفئران صغيرة بما يكفي لتكون جزءا لا يتجزأ من دون خلق آفة كبيرة. زرع حبة ملليمتر تحجيم داخل الدماغ لأغراض في الجسم الحي لن تعمل، في حين أن الميكروبات ملفقة باستخدام هذا البروتوكول لديه حجم مناسب لإدراج داخل قرن آمون من الفئران.
للتأكد من أننا قد حصلت على توزيع متكافئ للخلايا في المنتج النهائي، من المهم أن تخلط تماما الخلايا في تعليق alginate الخلية، وهذا يضمن الإفراج موحد اميلويد من كل ميكروبات.
