يصف بروتوكولنا التعديل الوراثي لخلية CAR-T أثناء تصنيعها عبر تقنية CRISPR لتوليد منتج أكثر فعالية وأقل سمية. ومن مزايا هذه التقنية أن إنتاج الخلايا CAR-T والتلاعب الجيني يمكن أن يحدثا في خلية واحدة بكفاءة جيدة. وسوف يكون إثبات الإجراء روزالي ستيرنر، طالبة دكتوراه في الطب، وميشيل كوكس، أخصائية تقنية وطالبة دراسات عليا، وروونا ساكيمورا، زميلة ما بعد الدكتوراه، من مختبري.
بعد عزل الخلايا التائية من خلايا الدم الطرفية أحادية النوى، ابدأ في زراعةها عن طريق إعداد خلية T أولاً المتوسطة ثم تعقيمها عن طريق تصفيتها من خلال فلتر فراغ معقم 0.45 ميكرومتر ثم مع فلتر فراغ معقم 0.22 ميكرومتر. في يوم من التحفيز T-الخلية أو يوم صفر, قبل التحفيز, غسل CD3/CD28 الخرز عن طريق وضع حجم المطلوب من الخرز في أنبوب microcentoruge 1.5 milliliter معقمة و resuspending في ملليلتر واحد من TCM. ضع الأنبوب على اتصال مع المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.
ثم تطن TCM و resuspend في ملليلتر واحد من TCM الطازجة لغسل الخرز مرة أخرى وتكرار ما مجموعه ثلاثة يغسل. وأخيرا، resuspend الخرز في ملليلتر واحد من TCM. بعد عد الخلايا التائية، نقل الخرز إلى الخلايا التائية بنسبة ثلاثة إلى حبات واحدة إلى خلايا.
ثم تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من مليون خلية لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحصول على بناء CART19 في متجه من العدس ، قم بأداء إنتاج العدسي فيفيرال عن طريق حضن أول بلازمات ، متجه التعبئة ، متجه المغلف ، مُعَد مُعَد ، مُشفر مُنْتَرَب ، ووسيلة نقل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. القيام بأعمال العدس باستخدام الاحتياطات BSL2 + بما في ذلك أغطية الخلية ثقافة، ومعدات الحماية الشخصية، وتطهير المواد المستخدمة مع التبييض قبل التخلص منها.
بعد الاحتضان، إضافة هذه الكواشف transfection إلى 293 T-الخلايا التي وصلت إلى 70 إلى 90٪ التقاء وتربية الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في 24 و 48 ساعة بعد transfection، والحصاد، والطرد المركزي، وتصفية ومركزة التي تحتوي على الفيروس فوق النفي وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. في اليوم الأول، إعادة التركيز بلطف الخلايا التائية التي تم تحفيزها في مليون خلية لكل ملليلتر في اليوم صفر من أجل تفريق الورديات من الخلايا.
في إطار الاحتياطات BSL2 + المناسبة، إضافة فيروس حصاد الطازجة أو المجمدة إلى الخلايا التائية محاكاة في تعدد العدوى من 3.0. مواصلة احتضان الخلايا التائية المستحثة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في الأيام الثالثة والخامسة، عد خلايا CAR-T وإضافة TCM جديدة قبل الدفء إلى الثقافة للحفاظ على تركيز خلية CAR-T من مليون خلية لكل ملليلتر.
بعد ستة أيام من المحاكاة، وإزالة الخرز من الخلايا التائية المُعادة عن طريق الحصاد أولاً وإعادة تعليق الخلايا. نقل الخلايا في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر ووضع الأنابيب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. بعد جمع الخلايا التي تحتوي على CAR-T supernatant والتخلص من الخرز، وضع الخلايا مرة أخرى في الثقافة بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر في قارورة الثقافة.
استخدم عينة من الخلايا لجرية تدفق الخلايا لتقييم التعبير السطحي للـ CARs. احتضان البقية لاستئناف التوسع ثم حصاد وحفاظ الخلايا في اليوم الثامن كما هو موضح في المخطوطة. لتعطيل عامل تحفيز مستعمرة الضامة الحبيبية، استخدم دليل RNA كما هو موضح في المخطوطة.
يحضن الكواشف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، إضافتها إلى 293 T-الخلايا التي وصلت إلى 70 إلى 90٪ التقاء وتربية الخلايا المُصابة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لإنتاج فيروس العدس. في 24 و 48 ساعة، والحصاد والتركيز التي تحتوي على الفيروس supernatant عن طريق الطرد الشديد في 50 ملليلتر أنابيب فائقة الحرارة وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
ثم في اليوم الأول، إعادة تعليق بلطف الخلايا التائية لتفريق الورود. في مختبر معتمد من BSL2+، لتوليد خلايا CAR-T، أضف فيروس العدس CAR19 وفيروس النسل الثلاثي الريكسر الذي يستهدف الخلايا التائية. في اليوم الثالث واليوم الخامس ل الخلايا التائية التي تم تحريرها من قبل LentiCRISPR بنجاح، وهي تحمل مقاومة البورومايسين، تعالج الخلايا التي تحتوي على البوروميسين ديهيدروكورايد بتركيز ميكروغرام واحد من البورومايسين لكل ملليلتر.
تم استخدام تسلسل المد لتأكيد تخفيض GM-CSF في خلايا GM-CSF خروج المغلوب CART19 مع كفاءة تعطيل ما يقرب من 71٪ تدفق المؤامرات من سطح الخلية CAR-T تلطيخ على الخلايا الإيجابية CD3 حية تبين أن كلا من البرية من نوع CART19 وجنرال موتورز-CSF خروج المغلوب CART19 بنجاح وبطريقة مماثلة التعبير عن مستقبلات سطح CAR في المختبر. من ناحية أخرى، تلطيخ داخل الخلايا من GM-CSF بواسطة تدفق cytometry بوابات أيضا على الخلايا الإيجابية CD3 حية يوضح انخفاض التعبير عن GM-CSF في خلايا خروج المغلوب مقارنة مع خلايا CART19 البرية من النوع مما يؤكد النجاح الوظيفي لل بالضربة القاضية. وينبغي توخي الحذر بشكل خاص أثناء خطوات النقل لهذا الإجراء لأنها الأكثر أهمية لتطوير خلايا CAR-T المعدلة وراثيا.
ويمكن تطبيق المنهجية المذكورة على مجموعة متنوعة من الجينات لتعديل خلايا CAR-T عبر CRISPR/CAS9 للمساعدة في توليد منتج أقل سمية وأكثر فعالية. توفر تكنولوجيا CRISPR/CAS9 استراتيجيات لاستهداف جينوم خلايا CAR-T مباشرة لهندسة الحلول لأوجه القصور السريرية الحالية.
