使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 电池中敲除 GM-CSF

我们的协议描述了 CAR-T细胞在通过CRISPR技术制造过程中的基因改造，以产生更有效、毒性更小的产品。该技术的优点是，CAR-T细胞的产生和基因操作都可以在一个细胞中发生，效率高。展示这个程序的将是罗莎莉·斯特纳，一个医学博士，米歇尔·考克斯，一个技术专家和研究生，和雷奥娜·萨克穆拉，一个博士后研究员，从我的实验室。

将T细胞从收获的外周血单核细胞中隔离后，首先制备T细胞介质，然后通过0.45微米无菌真空过滤器过滤，然后用0.22微米无菌真空过滤器进行消毒。从采集的外周血单核细胞开始培养T细胞。在T细胞刺激日或零日，在刺激前，将所需的珠子放入无菌1.5毫升微离心管中，并在一毫升的中药中重新保存，清洗CD3/CD28珠子。将管子与磁铁接触一分钟。

然后吸进中医，再用一毫升新鲜中医重新洗珠子，再重复三次洗涤。最后，在一毫升的中医中重新暂停珠子。计算T细胞后，以三比一珠与细胞的比例将珠子转移到T细胞。

然后稀释细胞，最终浓度为每毫升100万个细胞，并在37摄氏度、5%CO2下孵育24小时。在扁病毒载体中获取 CART19 结构后，首先在室温下孵育扁病毒质粒、包装载体、包络载体、预复杂试剂、转染试剂和转染介质进行 30 分钟的转染培养。使用 BSL2® 预防措施进行扁病毒工作，包括细胞培养罩、个人防护设备以及处理前用漂白剂对用过的材料进行消毒。

孵育后，将这些转染试剂加入293个T细胞中，这些T细胞达到70至90%的汇合率，并在37摄氏度和5%CO2下培养转染细胞。在转染后24小时和48小时，收获、离心机、过滤和浓缩含有病毒的上流物质，通过超离心和冷冻在零下80摄氏度，供将来使用。在第一天，轻轻地重新暂停T细胞，在零日以每毫升100万细胞被刺激，以分解细胞的玫瑰花环。

在适当的 BSL2® 预防措施下，在 3.0 的多重感染下，将新鲜或冷冻收获的病毒添加到模拟 T 细胞中。继续在37摄氏度，5%的CO2下孵育转导T细胞。第三天和第五天，计算 CAR-T 细胞，并将新鲜预热的 TCM 添加到培养物中，以保持 CAR-T 细胞浓度为每毫升一百万个细胞。

模拟六天后，通过首先收获和重新暂停细胞，从转导的T细胞中去除珠子。将细胞在50毫升锥形管中转移，将管子放在磁铁中一分钟。在收集含有 CAR-T 细胞的上经剂并丢弃珠子后，将细胞以每毫升一百万个细胞的浓度放回培养瓶中。

使用流式细胞学的细胞样本来评估 CAR 的表面表达式。孵育其余的恢复扩张，然后收获和冷冻保存细胞在第8天，如手稿中所述。要破坏粒细胞巨噬细胞群刺激因子，请使用手稿中描述的引导RNA。

在室温下孵育转染试剂30分钟。孵育后，将它们添加到达到70-90%汇合的293个T细胞中，并在37摄氏度、5%CO2下培养转染细胞，产生扁病毒。在24和48小时，收获和浓缩含有病毒的上流水，通过超离心在50毫升超离心管和冻结在零下80摄氏度供将来使用。

然后第一天，轻轻地重新暂停T细胞，以打破玫瑰花环。在 BSL2+ 批准的实验室中，为了生成 CAR-T 细胞，将 CAR19 扁家病毒和 GMCSF 靶向CRISPR扁病毒添加到模拟T细胞中。在第三天和第五天成功转导含有紫霉素抗药性克伦霉素的百联化T细胞，以每毫升1微克的紫丙胺素浓度治疗具有紫霉素的细胞。

潮汐测序用于确认GM-CSF敲除C CART19细胞的GM-CSF减少，在活CD3阳性细胞上封闭的 CAR-T细胞表面染色的中断效率约为71%，表明野生型C前19和GM-CSF敲除C CART19均成功，以类似方式在体外表达 CAR表面受体。另一方面，通过流式细胞学对GM-CSF的细胞内染色也封闭在活的CD3阳性细胞上，表明与野生型C前19细胞确认敲解功能成功的野生T前19细胞相比，GM-CSF在敲解细胞中的表达减少。在这个程序的转导步骤中应特别注意，因为它们对转基因 CAR-T 细胞的发展至关重要。

所述方法可能应用于各种基因，通过CRISPR/CAS9修改 CAR-T 细胞，以帮助生成毒性更低、更有效的产品。CRISPR/CAS9 技术提供了直接针对 CAR-T 细胞基因组的策略，以设计解决当前临床缺陷的解决方案。