Protokolümüz, DAHA etkili ve daha az toksik ürün üretmek için CRISPR teknolojisi ile üretim leri sırasında CAR-T hücresinin genetik modifikasyonu açıklar. Bu tekniğin bir avantajı CAR-T hücre üretimi ve genetik manipülasyon hem iyi verimlilik ile bir hücrede oluşabilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Rosalie Sterner, bir MD doktora öğrencisi, Michelle Cox, bir teknoloji ve yüksek lisans öğrencisi, ve Reona Sakemura, doktora sonrası adam, benim laboratuvar dan olacaktır.
Hasat edilen periferik kan mononükleer hücrelerinden T-hücrelerini izole ettikten sonra, önce T-hücre ortamını hazırlayarak ve daha sonra 0,45 mikrometre steril vakum filtresi nden ve ardından 0,22 mikrometrelik steril vakum filtresi ile filtreleyerek sterilize ederek onları toplamaya başlayın. T-hücre stimülasyonu veya sıfır günü, stimülasyon dan önce, steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp boncuk gerekli hacmi yerleştirerek ve TCM bir mililitre resuspend cd3/CD28 boncukyı yıkayın. Bir dakika için bir mıknatıs ile temas tüp yerleştirin.
Daha sonra TCM aspire ve taze TCM bir mililitre tekrar boncuk yıkamak ve üç yıkama toplam tekrar. Ve son olarak, tcm bir mililitre boncuk askıya. T-hücrelerini sayarak, boncukları t-hücrelerine üç ila bir boncuk oranında hücrelere aktarın.
Daha sonra hücreleri mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonuna seyreltin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın, 24 saat boyunca %5 CO2. Lentiviral vektörde cart19 konstrüksiyonu aldıktan sonra, lentiviral plazmid, ambalaj vektörü, zarf vektörü, precomplexing reaktifi, transfeksiyon reaktifi ve transfeksiyon ortamını oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatarak lentiviral üretim gerçekleştirin. Hücre kültürü başlıkları, kişisel koruyucu ekipmanlar ve kullanılmış malzemelerin imha edilmeden önce çamaşır suyu ile dezenfeksiyonu da dahil olmak üzere BSL2+önlemler kullanarak lentiviral iş yapmak.
Kuluçkadan sonra, bu transfeksiyon reaktiflerini %70-90'a ulaşan 293 T-hücresine ekleyin ve transfected hücreleri 37 santigrat derece ve %5 CO2'de kültüre aktarın. Transfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra, hasat, santrifüj, filtre ve ultrasantrifüj ile virüs içeren konsantre supernatant ve gelecekteki kullanım için eksi 80 santigrat derece donma. İlk gün, hücrelerin rozetlerini kırmak için sıfır gününde mililitre başına bir milyon hücrede uyarılan T-hücrelerini nazikçe yeniden askıya alın.
Uygun BSL2+ önlemleri altında, 3.0 enfeksiyon çokluğu simüle T-hücrelerine taze veya dondurulmuş hasat virüs ekleyin. Transekten T hücrelerini 37 santigrat derecede, %5 CO2'de kuluçkaya yatırmaya devam edin. Üçüncü ve beşinci günlerde, CAR-T hücrelerini sayın ve mililitre başına bir milyon hücreden oluşan CAR-T hücre konsantrasyonu sağlamak için kültüre taze önceden ısıtılmış TCM ekleyin.
Simülasyondan altı gün sonra, ilk hasat ve hücreleri yeniden sulama tarafından transduced T-hücrelerinden boncuk kaldırın. Hücreleri 50 mililitrelik konik tüpler halinde aktarın ve tüpleri bir dakika lığına mıknatısa yerleştirin. CAR-T hücre içeren supernatant toplandıktan ve boncuk atarak sonra, bir kültür şişesi mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu olarak kültür hücreleri geri yerleştirin.
CAR'lerin yüzey ekspresyonunu değerlendirmek için akış sitometrisi için bir hücre örneği kullanın. Genişlemeye devam etmek için geri kalanını kuluçkaya yatırın ve sonra el yazmasında açıklandığı gibi sekizinci günde hücreleri hasat edip kriyo-korumak. Granülosit makrofaj koloniuyarıcı faktör bozmak için, el yazması açıklandığı gibi bir kılavuz RNA kullanmak.
30 dakika oda sıcaklığında transfeksiyon reaktifleri inkübat. Kuluçkadan sonra, %70-90'a ulaşan 293 T hücresine ekleyin ve transfected hücreleri 37 santigrat derecede, %5 CO2'de merceksi bir virüs üretmek için kültüre dönüştürün. 24 ve 48 saat, hasat ve konsantre virüs içeren supernatant ultracentrifugation tarafından 50 mililitre ultracentrifuge tüpler ve eksi 80 derece santigrat gelecekteki kullanım için dondurma.
Sonra ilk gün, rozetleri kırmak için T-hücrelerini nazikçe askıya alın. Bir BSL2 + onaylı laboratuvarda, CAR-T hücreleri oluşturmak için, simüle T-hücreleri CAR19 lentivirus ve GMCSF hedefleyen CRISPR lentivirus ekleyin. Puromisin direnci taşıyan lentiCRISPR tarafından düzenlenmiş T hücreleri için üçüncü gün ve beşinci gün, mililitrede bir mikrogram puromisin konsantrasyonu yla hücreleri puromisin dihidroklorürile tedavi edin.
Gelgit sıralaması GM-CSF nakavt CART19 hücrelerinde bir GM-CSF azalma onaylamak için kullanılan yaklaşık bir bozulma verimliliği ile 71% CAR-T hücre yüzeyi canlı CD3-pozitif hücreler üzerinde gated akış arsalar hem vahşi tip CART19 ve GM-CSF nakavt CART19 başarıyla ve benzer bir moda içinde car yüzey reseptörü in vitro ifade göstermektedir. Öte yandan, gm-BOS'un akış sitometrisi ile hücre içi boyanması da canlı CD3-pozitif hücrelerde geçilen gm-CSF'nin nakavt hücrelerinde yaban tipi CART19 hücrelerine göre azalan ekspresyonun uyanışını göstermektedir. Genetik olarak modifiye edilmiş CAR-T hücrelerinin gelişimi için en kritik olan bu işlemin transdüksiyon adımları sırasında özellikle dikkatli olunmalıdır.
Açıklanan metodoloji, daha az toksik ve daha etkili bir ürün üretmeye yardımcı olmak için CRISPR/CAS9 üzerinden CAR-T hücrelerini değiştirmek için çeşitli genlere uygulanabilir. CRISPR/CAS9 teknolojisi, car-t hücrelerinin genomunu doğrudan hedeflemek ve mevcut klinik eksikliklere çözümler tasarlamak için stratejiler sağlar.
