Notre protocole décrit la modification génétique des cellules CAR-T lors de leur fabrication via la technologie CRISPR pour générer des produits plus efficaces et moins toxiques. Un avantage de cette technique est que la production de cellules CAR-T et la manipulation génétique peuvent toutes deux se produire dans une cellule avec une bonne efficacité. Rosalie Sterner, doctorante en médecine, Michelle Cox, technologue et étudiante aux cycles supérieurs, et Reona Sakemura, stagiaire postdoctorat, de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Après avoir isolé les cellules T des cellules mononucléaires périphériques récoltées, commencez à les cultiver en préparant d’abord le milieu des cellules T, puis en le stérilisant en le filtrant à travers un filtre à vide stérile de 0,45 micromètre, puis à l’aide d’un filtre à vide stérile de 0,22 micromètre. Le jour de la stimulation des lymphocytes T ou du jour zéro, avant la stimulation, lavez les perles CD3/CD28 en plaçant le volume requis de perles dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et en réutilisant en un millilitre de TCM. Placez le tube en contact avec un aimant pendant une minute.
Ensuite, aspirez le TCM et resuspendez dans un millilitre de TCM frais pour laver les perles à nouveau et répéter pour un total de trois lavages. Et enfin, resuspendez les perles dans un millilitre de TCM. Après avoir compté les cellules T, transférer les perles aux cellules T à un rapport de trois à une perle aux cellules.
Ensuite, diluer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pendant 24 heures. Après l’acquisition d’une construction CART19 dans un vecteur lentiviral, effectuez la production de lentiviral en couveant d’abord le plasmide lentiviral, vecteur d’emballage, vecteur d’enveloppe, réagent précomplexant, réagent de transfection et milieu de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuer des travaux lentiviraux en utilisant bsl2 +précautions, y compris les hottes de culture cellulaire, l’équipement de protection individuelle, et la désinfection des matériaux utilisés avec de l’eau de Javel avant l’élimination.
Après l’incubation, ajouter ces réhabilités de transfection aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius et 5%CO2. À 24 et 48 heures après la transfection, la récolte, la centrifugeuse, le filtre et le concentré contenant des virus supernatants par ultracentrifugation et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Le premier jour, résuspendez doucement les cellules T qui ont été stimulées à un million de cellules par millilitre le jour zéro afin de briser les rosettes des cellules.
Selon les précautions appropriées bsl2+, ajouter le virus récolté frais ou congelé aux cellules T simulées à une multiplicité d’infection de 3,0. Continuer à couver les t-cells transduced à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Les jours trois et cinq, comptez les cellules CAR-T et ajoutez du TCM frais préchauffé à la culture pour maintenir une concentration de cellules CAR-T d’un million de cellules par millilitre.
Six jours après la simulation, retirer les perles des cellules T transduites en récoltant et en réutilisant les cellules. Transférer les cellules dans des tubes coniques de 50 millilitres et placer les tubes dans un aimant pendant une minute. Après avoir recueilli le supernatant contenant des cellules CAR-T et jeté les perles, remettre les cellules en culture à une concentration d’un million de cellules par millilitre dans un flacon de culture.
Utilisez un échantillon de cellules pour la cytométrie du débit afin d’évaluer l’expression de surface des DRC. Incuber le reste pour reprendre l’expansion, puis récolter et cryo-préserver les cellules au huitième jour comme décrit dans le manuscrit. Pour perturber le facteur stimulant de la colonie de macrophages granulocytes, utilisez un ARN guide tel que décrit dans le manuscrit.
Incuber les réhésifs transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez-les aux 293 cellules T qui ont atteint 70 à 90% de confluence et de la culture des cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5%CO2 pour produire un lentivirus. À 24 et 48 heures, récolter et concentrer le supernatant contenant des virus par ultracentrifugation dans des tubes ultracentrifugeuses de 50 millilitres et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.
Puis, le premier jour, résuspendez doucement les T-cells pour briser les rosettes. Dans un laboratoire approuvé par BSL2+, pour produire des cellules CAR-T, ajoutez le lentivirus CAR19 et le lentivirus CRISPR ciblant le GMCSF aux cellules T simulées. Le troisième jour et le cinquième jour pour les cellules T éditées avec succès par lentiCRISPR portant la résistance de puromycine, traitent des cellules avec le dihydrochlorure de puromycine à une concentration d’un microgramme de puromycine par millilitre.
Le séquençage des marées a été utilisé pour confirmer une réduction de GM-CSF dans les cellules CART19 à élimination directe GM-CSF avec une efficacité de perturbation d’environ 71 % Les parcelles de surface des cellules CAR-T entachées sur des cellules CD3 positives vivantes montrent que cart19 et GM-CSF knockout CART19 de type sauvage réussissent et expriment de la même manière le récepteur de surface CAR in vitro. D’autre part, la coloration intracellulaire de GM-CSF par cytométrie d’écoulement également fermée sur les cellules CD3-positives vivantes démontre l’expression diminuée de GM-CSF dans les cellules de KNOCKOUT comparées aux cellules cart19 de type sauvage confirmant le succès fonctionnel du KO. Un soin particulier doit être pris pendant les étapes de transduction de cette procédure car elles sont les plus critiques pour le développement des cellules CAR-T génétiquement modifiées.
La méthodologie décrite peut potentiellement être appliquée à une variété de gènes pour modifier les cellules CAR-T via CRISPR/CAS9 pour aider à générer un produit moins toxique et plus efficace. La technologie CRISPR/CAS9 fournit les stratégies pour cibler directement le génome des cellules CAR-T afin de concevoir des solutions aux lacunes cliniques actuelles.
