特定のタンパク質機能が遺伝子操作によって変わる場合、刺激性障害と運動走行障害の調整は、LTDと運動学習との因果関係に必要な条件と考えられる。ここでは、遺伝子操作された動物の補償機構を介して誘導することができるLTDを評価するための複数のプロトコルの使用を実証する。脳を収穫する前に、氷の上にACSFの2つの50ミリリットルビーカーを冷やして酸素化する。
溶液温度が摂氏4度以下になったら、氷冷ビーカーの1つに1ミリモルテトロドトキシンの50マイクロリットルを加えます。脳を収穫するには、頭を保持し、中線に沿って表面的な皮膚をカットするために眼科用のはさみを使用します。手動で皮膚を引き込んで頭蓋骨の表面を広く露出させ、両眼の上の線に沿って頭蓋骨を切断する前に、主要な脊髄小脳孔から目と耳のすぐ上に頭蓋骨に沿って水平に頭蓋骨に沿って切断するためにはさみを使用します。
メスを使って大脳の真ん中で脳を切断し、小脳を含む脳の尾部を頭蓋骨から分離する。サンプルをACSFの氷冷ビーカーに浸し、ビーカーの脳ブロックをかき混ぜないように気泡管を調整します。少なくとも7分後、スパチュラを使用して脳ブロックを拾い、濾紙を使用して余分なACSFを吸収します。
組織腹側を適切な医療用接着剤で2センチメートルの寒天に下に取り付ける。ブレードを使用して、パーキンエ細胞の樹状平面に平行に脳組織の右半球を切り取ります。半球の反対側を切り取って取り除き、上司と下のコリの間の脳を切断します。
脊髄を切断し、トリミングされた小脳の右側を寒天ブロックで冷蔵前の標本トレイに接着します。次に、試料トレイを傾け、試料にACSFを注ぎ、組織を固定し、余分な接着剤を洗い流します。脳試料をスライスするには、小脳の後側が前部にあるように試料を配向し、小脳を完全に浸漬するためにテトロドトキシンを補った氷冷切断ACSFを十分に注ぐ。
ガスチューブを切断液に入れ、酸素二酸化炭素ガス混合物でバブリングを開始します。細かいピンセットと拡大鏡を使用して、くも膜の合体を取り除き、小脳ペダンクを切除します。脳幹と寒天ブロックを取り外した後、小脳の背部表面がビブラートメのカミソリの刃に面するようにトレイを180度回転させ、最初の切断位置を調整します。
ビブラートメ振幅を5.5、周波数を85ヘルツ、速度を3~4、スライスの厚さを300マイクロメートルに設定します。小脳スライスが得られると、ナイロンネットを使用して、26°Cの水浴中のアクリルインキュベーターに切片を移し、サンプルを少なくとも1時間は新鮮な酸素化されたACSFに完全に浸漬します。全細胞パッチクランプ報告のために、30°Cの記録室を1分毎の流量で毒素溶液と浸透させる前に、3分間ウルタソニン処理によってACSFに1マイクロモルピクトキシンを溶解する。
数分後、小脳スライスを記録室に移し、白金重量とナイロン糸で組織を固定します。次に、刺激電極に新鮮なACSFを充填します。平行繊維を刺激するために、刺激電極をプルキンエ細胞層から約50マイクロメートルの分子層の表面に置く。
クライミング繊維の刺激のために、刺激電極をPurkinje細胞層の底部に置き、マイクロローダーを使用して、0.45マイクロメートルの8マイクロリットルのろ過カリウムまたはセシウムベースの内部溶液で記録電極を充填します。電中電極をACSFに浸す前に、弱い正圧を記録電極に適用します。電極抵抗は2~4メガオームで、液体接合電位は補正する必要があります。
記録電極でプルキンエセルの健康な明るい細胞体に近づき、プルキンエセルの表面をわずかに押します。その後、正圧を加えるのをやめて、ギガオームシールが形成されるまで負圧を加えます。次に、負圧を使用して細胞全体の構成を確立し、膜電位をマイナス70ミリボルトで維持し、0.1ヘルツでマイナス2ミリボルト100ミリ秒パルスを適用し、入力抵抗、直列抵抗、入力キャパシタンスを連続的に監視します。
長期の抑うつ誘導の場合、0.1ミリ秒のパルスで分子層を刺激し、二重パルス刺激を適用して、シナプス後の並列繊維励起電流を識別します。刺激強度の増加に対する振幅のペア化されたパルス促進と漸進的な増加が観察されるべきである。テスト応答を記録するには、単一の0.1ヘルツパルスを適用し、呼び起こされる振幅が約200ピコアンプになるように刺激の強度を調整します。
プルキンエ細胞層の底部のクライミング繊維を刺激し、クライミング繊維活性化によって引き起こされる並列繊維励起後シナプス電流を同定し、二重パルス刺激を加える。ペアになったパルスうつ病は、刺激強度の増加と相関して、すべてまたは全く観察されるべきである。本代表実験では、1つの並列繊維刺激と電流クランプ条件下での1つのクライミング繊維刺激の組み合わせがスライス調製に使用された。
結膜刺激によって引き出される複雑なスパイクの形状は、最初の急なスパイクレットとそれに続く2〜3つのスパイクレットを伴うクライミング繊維刺激によって引き出されたものと類似していた。同様の形状の複雑なスパイクは、1つの平行繊維刺激が50ミリ秒後に結膜第2並列および上昇繊維刺激によって続いたときに観察された。セシウムベースの内部溶液を用いた電圧クランプ条件下でのこの試験では、並列繊維刺激を50ミリ秒後に、第2の平行繊維刺激と体細胞脱分極の併用によって続いた。
内流は、マイナス70からゼロミリボルトへの体細胞脱分極時に引き起こされ、尾電流も再分極化後に呼び起こされた。最後に、100ヘルツで5つの並列ファイバ刺激を、電圧クランプ条件下での体的脱分極と同時に与えた。再分極化の際に、逆方向電流の繰り返し発生が引き起こされたとし、再分極後に尾電流が誘導された。
遺伝子操作動物における小脳LTDと運動学習との関係を評価するには、複数のプロトコルを使用して、居心地の良い生理学的条件下でLTDを誘導する必要があります。小脳LTDが運動学習後に遺伝子操作動物で可視化される場合、それらの間の因果関係をより直接的に調べることができます。
