특정 단백질 기능이 유전자 조작에 의해 변형될 때, 자극실패및 운동 실행 장애의 조정은 LTD와 모터 학습 사이 인과 관계에 필요한 조건으로 간주됩니다. 여기서 우리는 유전자 조작 된 동물의 보상 메커니즘을 통해 유도 될 수있는 LTD를 평가하기 위해 여러 프로토콜의 사용을 보여줍니다. 뇌를 수확하기 전에 얼음 위에 ACSF의 50 밀리리터 비커 두 개를 차갑게 하고 산소를 공급합니다.
용액 온도가 섭씨 4도 이하로 도달하면 얼음 차가운 비커 중 하나에 1 밀리머 테트로독신 50 마이크로리터를 추가하십시오. 뇌를 수확하려면 머리를 잡고 안과 가위를 사용하여 중간선을 따라 피상적 인 피부를 자른다. 수동으로 두개골 표면을 노출하고 가위를 사용하여 주요 척추 내뇌 구멍에서 눈과 귀 바로 위에 두개골을 수평으로 자르는 후 양쪽 눈 위의 선을 따라 두개골을 절단합니다.
메스를 사용하여 뇌의 중간에 있는 뇌를 자르고 두개골에서 소뇌를 포함한 뇌의 소달 부분을 분리합니다. ACSF의 얼음 차가운 비커에 샘플을 담그고 비커의 뇌 블록을 교반하지 않도록 거품 튜브를 조정합니다. 적어도 7 분 후, 뇌 블록을 선택하고 여분의 ACSF를 흡수하기 위해 필터 종이의 조각을 사용하는 주걱을 사용합니다.
적절한 의료 접착제와 천의 2 센티미터 조각에 조직 복부 측면을 아래로 마운트. 블레이드를 사용하여 Purkinje 세포의 수지상 평면과 가능한 한 병렬로 뇌 조직의 오른쪽 반구를 잘라냅니다. 반구의 다른 쪽을 잘라내고 제거하고 우수한 콜리큘리 사이의 뇌를 잘라냅니다.
척수를 잘라 미리 차가운 표본 트레이에 천막 블록으로 손질 된 소뇌의 오른쪽을 접착제. 그런 다음, 표본 트레이를 기울이고, 조직을 고치고 여분의 접착제를 씻어 샘플에 ACSF를 부어. 뇌 샘플을 슬라이스하기 위해, 소뇌의 등쪽측이 전면에 있고 테트로독신으로 보충된 얼음 냉간 절단 ACSF를 충분히 부어 소뇌에 완전히 침지하도록 시편을 지향한다.
가스관을 절삭 액에 넣고 산소 이산화탄소 가스 혼합물로 버블링을 시작합니다. 미세 핀셋과 돋보기를 사용하여 거미 류를 제거하고 소뇌 페달을 제거합니다. 뇌간과 천 블록을 제거한 후, 소뇌의 등쪽 표면이 진동의 면도날을 마주하고 첫 번째 절단 위치를 조절하도록 트레이180도 회전한다.
진동진폭을 5.5로 설정하고 주파수를 85 헤르츠로, 속도는 3~4로, 슬라이스 두께를 300 마이크로미터로 설정합니다. 소뇌 슬라이스가 얻어지므로 나일론 그물을 사용하여 26도 의 수조에서 아크릴 인큐베이터로 섹션을 옮기고 적어도 한 시간 동안 신선한 산소 ACSF에 샘플을 완전히 담급니다. 전체 세포 패치 클램프 보고의 경우, 분당 2밀리리터의 독소 용액으로 섭씨 30도 기록 챔버를 인퓨전하기 전에 3분 동안 ACSF에 마이크로몰라 피크로톡신 1개를 용해한다.
몇 분 후, 소뇌 조각을 기록 챔버로 옮기고 백금 무게와 나일론 실로 조직을 고정시십시오. 그런 다음 자극하는 전극을 신선한 ACSF로 채웁니다. 병렬 섬유를 자극하기 위해, Purkinje 세포 층에서 약 50 마이크로미터분자 층의 표면에 자극 전극을 배치합니다.
등반 섬유의 자극을 위해, 자극 전극을 Purkinje 세포 층의 바닥에 놓고 마이크로 로더를 사용하여 0.45 마이크로 미터 여과 칼륨 또는 세슘 기반의 내부 용액의 8 개의 마이크로 리터로 기록 전극을 채웁니다. ACSF에 전극을 침지하기 전에 기록 전극에 약한 양압을 가하십시오. 전극 저항은 2~4메가옴이어야 하며 액체 접합 전위도 를 수정해야 합니다.
기록 전극으로 Purkinje 세포의 건강한 밝은 세포 체체에 접근하고 Purkinje 세포의 표면을 약간 밀어 넣습니다. 그런 다음 양압을 바르는 것을 멈추고 기가움 씰이 형성될 때까지 음압을 가하십시오. 그런 다음 음성 압력을 사용하여 전체 셀 구성을 확립하고, 영하 70밀리볼트에서 멤브레인 전위를 유지하고 0.1 헤르츠에서 마이너스 2 밀리볼트 100 밀리초 펄스를 적용하고 입력 저항, 시리즈 저항 및 입력 커패시턴스를 지속적으로 모니터링합니다.
장기 우울증 유도의 경우 0.1 밀리초 펄스로 분자 층을 자극하고 이중 펄스 자극을 적용하여 병렬 섬유 흥분 성 후 시냅스 전류를 식별합니다. 자극 강도의 증가에 비해 쌍이 결합된 펄스 촉진 및 진폭의 점진적 증가를 관찰해야 한다. 시험 반응을 기록하려면, 단일 0.1 헤르츠 펄스를 적용하고 자극의 강도를 조정하여 방출진환이 약 200 피코앰프입니다.
Purkinje 세포 층의 바닥에 등반 섬유를 자극하고 등반 섬유 활성화에 의해 유도 된 병렬 섬유 흥분 후 전류를 식별하기 위해, 이중 펄스 자극을 적용합니다. 쌍이 있는 펄스 불경기는 자극 강도의 증가와 상관관계에 있는 전부 또는 없음 방식으로 관찰되어야 합니다. 본 대표적인 실험에서는, 현재 클램프 조건 하에서 하나의 병렬 섬유 자극과 하나의 등반 섬유 자극의 결합이 슬라이스 제제에 사용되었다.
결막 자극에 의해 유도된 복잡한 스파이크의 형상은 첫 번째 가파른 스파이크렛을 가진 것만으로 등반 섬유 자극에 의해 유도된 것과 유사했으며, 그 다음으로 2~3개의 스파이크릿이 뒤따랐다. 유사하게 형성된 복잡한 스파이크는 결막 제2 병렬 및 등반 섬유 자극에 의해 50밀리초 후에 하나의 병렬 섬유 자극을 따를 때 관찰되었다. 세슘 기반 내부 용액을 이용한 전압 클램프 조건 하에서 이 테스트에서, 두 번째 병렬 섬유 자극 및 체질 탈극화를 수반하여 50밀리초 후에 병렬 섬유 자극을 수행하였다.
내전류는 영하 70에서 0 밀리볼트로 체세포 탈극화를 유도하고 꼬리 전류도 변각화 후 연상되었다. 마지막으로, 100 헤르츠에서 5개의 병렬 섬유 자극을 전압 클램프 조건하에서 체세포 탈극화와 동시에 투여하였다. 다시 말하지만, 탈극화 중에 내류의 반복적인 생성이 유도되었고, 꼬리 전류는 재분화 후 유도되었다.
유전자 조작 된 동물에서 소뇌 LTD와 모터 학습 사이의 관계를 평가하기 위해, 여러 프로토콜은 아늑한 생리 조건하에서 LTD를 유도하는 데 사용되어야한다. 소뇌 LTD가 모터 학습 후 유전자 조작 된 동물에서 시각화되는 경우, 그들 사이의 인과 관계는 더 직접적으로 조사 될 수 있습니다.
