Quando una particolare funzione proteica viene modificata dalla manipolazione genica, la coordinazione del fallimento irritativo e della compromissione del funzionamento motorio è considerata una condizione necessaria per la relazione causale tra LTD e l'apprendimento motorio. Qui dimostriamo l'uso di più protocolli per valutare ltd che possono essere indotti attraverso meccanismi di compensazione negli animali manipolati da geni. Prima di raccogliere il cervello, raffreddare e ossigenare due becher da 50 millilitri di ACSF sul ghiaccio.
Quando la temperatura della soluzione raggiunge i quattro gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri di una tetrodossina millimolare a uno dei becher ghiacciati. Per raccogliere il cervello, tenere la testa e usare forbici oftalmologiche per tagliare la pelle superficiale lungo la linea mediana. Ritrarre manualmente la pelle per esporre ampiamente la superficie del cranio e utilizzare le forbici per tagliare lungo il cranio orizzontalmente dal foro spinocerebellare principale a appena sopra gli occhi e le orecchie prima di tagliare il cranio lungo una linea sopra entrambi gli occhi.
Usa un bisturi per tagliare il cervello al centro del cerebro e isolare la parte caudale del cervello, incluso il cervelletto, dal cranio. Immergere il campione nel becher ghiacciato di ACSF e regolare il tubo a bolle in modo che non mescola il blocco cerebrale nel becher. Dopo almeno sette minuti, utilizzare una spatola per raccogliere il blocco cerebrale e utilizzare un pezzo di carta filtrante per assorbire l'ACSF in eccesso.
Montare il lato ventrale del tessuto su un pezzo di agar di due per due centimetri con un adesivo medico appropriato. Usa una lama per tagliare l'emisfero destro del tessuto cerebrale il più parallelo possibile al piano dendritico delle cellule di Purkinje. Tagliare e rimuovere l'altro lato dell'emisfero e tagliare il cervello tra i collicoli superiori e inferiori.
Tagliare il midollo spinale e incollare il lato destro del cervelletto tagliato con il blocco di agar sul vassoio del campione pre-refrigerato. Quindi, inclinando il vassoio del campione, versare ACSF sul campione per fissare il tessuto e lavare via la colla in eccesso. Per tagliare il campione cerebrale, orientare l'esemplare in modo che il lato dorsale del cervelletto sia nella parte anteriore e versare abbastanza ACSF di taglio freddo ghiacciato integrato con tetrodotossine per immergere completamente il cervelletto.
Posizionare un tubo del gas nella soluzione di taglio e iniziare a gorgogliare con una miscela ossigeno-anidride carbonica. Utilizzando pinzette e lente d'ingrandimento fini, rimuovere la mater aracnoide e asportare il pedunno cerebellare. Dopo aver rimosso il tronco encefalico e il blocco di agar, ruotare il vassoio di 180 gradi in modo che la superficie dorsale del cervelletto affronti la lama del rasoio del vibratoma e regolare la prima posizione di taglio.
Impostare l'ampiezza del vibratomo su 5,5 e la frequenza su 85 Hertz, la velocità a tre o quattro e lo spessore della fetta a 300 micrometri. Man mano che si ottengono le fette cerebellari, utilizzare una rete di nylon per trasferire le sezioni in un incubatore acrilico in un bagno d'acqua di 26 gradi celsius e immergere completamente i campioni in ACSF fresco ossigenato per almeno un'ora. Per la segnalazione del morsetto di patch a celle intere, sciogliere una picrotossine micromolare in ACSF per ultasonica per tre minuti prima di perfondire una camera di registrazione di 30 gradi celsius con la soluzione di tossina a una portata di due millilitri al minuto.
Dopo alcuni minuti, trasferire una fetta cerebellare alla camera di registrazione e fissare il tessuto con un peso di platino e fili di nylon. Quindi riempire un elettrodo stimolante con ACSF fresco. Per stimolare le fibre parallele, posizionare l'elettrodo stimolante sulla superficie dello strato molecolare a circa 50 micrometri dallo strato cellulare di Purkinje.
Per la stimolazione delle fibre rampicanti, posizionare l'elettrodo stimolante nella parte inferiore dello strato cellulare purkinje e utilizzare un microloader per riempire un elettrodo di registrazione con otto microlitri di soluzione interna filtrata di potassio o cesio da 0,45 micrometri. Applicare una debole pressione positiva sull'elettrodo di registrazione prima di immergere l'elettrodo nell'ACSF. La resistenza degli elettrodi deve essere da due a quattro megaohm e il potenziale di giunzione liquido deve essere corretto.
Avvicinati al corpo cellulare luminoso sano di una cella purkinje con l'elettrodo di registrazione e spingi leggermente la superficie della cellula di Purkinje. Quindi interrompere l'applicazione della pressione positiva e applicare la pressione negativa fino a formare una guarnizione gigaohm. Quindi utilizzare la pressione negativa per stabilire una configurazione a celle intere, mantenendo il potenziale della membrana a meno 70 millivolt e applicando un meno due impulsi millivolt 100 millisecondi a 0,1 hertz, monitoraggio continuo della resistenza all'ingresso, resistenza in serie e capacità di ingresso.
Per l'induzione della depressione a lungo termine, stimolare lo strato molecolare con un impulso di 0,1 millisecondi e applicare uno stimolo a doppio impulso per identificare le correnti post-sinaptiche eccitatorie della fibra parallela. Si dovrebbe osservare una facilitazione accoppiata dell'impulso e un graduale aumento dell'ampiezza rispetto all'aumento dell'intensità di stimolazione. Per registrare la risposta del test, applicare un singolo impulso di 0,1 hertz e regolare l'intensità dello stimolo in modo che l'ampiezza evocata sia di circa 200 picoampere.
Stimolare le fibre rampicanti nella parte inferiore dello strato cellulare purkinje e identificare le correnti post-sinaptiche eccitatorie in fibra parallela suscitate dall'attivazione della fibra rampicante, applicare uno stimolo a doppio impulso. Una depressione dell'impulso accoppiata deve essere osservata in tutto o in nessuno modo in correlazione con l'aumento dell'intensità di stimolazione. In questo esperimento rappresentativo, per la preparazione della fetta sono state utilizzate una combinazione di una stimolazione parallela della fibra e una stimolazione della fibra rampicatrice in condizioni di morsetto correnti.
La forma del picco complesso suscitato dalla stimolazione congiuntivo era simile a quella suscitata dalla sola stimolazione della fibra rampicanti con la prima spighetta ripida seguita da due o tre spighetta. Un picco complesso di forma simile è stato osservato quando una stimolazione parallela della fibra è stata seguita 50 millisecondi dopo da un secondo parallelo congiuntivo e stimolazione della fibra rampicanti. In questo test in condizioni di morsetto di tensione utilizzando una soluzione interna a base di cesio, una stimolazione parallela della fibra è stata seguita 50 millisecondi dopo da un'applicazione concomitante di una seconda stimolazione parallela della fibra e depolarizzazione somatica.
Una corrente verso l'interno fu suscitata dalla depolarizzazione somatica da meno 70 a zero millivolt e anche la corrente di coda fu evocata dopo la ripolarizzazione. Infine, cinque stimoli in fibra parallela a 100 hertz sono stati somministrati contemporaneamente alla depolarizzazione somatica in condizioni di morsetto di tensione. Ancora una volta, una generazione ripetitiva di correnti verso l'interno fu provocata durante la depolarizzazione e la corrente di coda fu indotta dopo la ripolarizzazione.
Per valutare la relazione tra cerebellar LTD e l'apprendimento motorio negli animali manipolati da geni, devono essere utilizzati protocolli multipli per indurre LTD in condizioni fisiologiche accoglienti. Se cerebellar LTD viene visualizzato negli animali manipolati da geni dopo l'apprendimento motorio, la relazione causale tra loro può essere esaminata più direttamente.
