البروتوكول المقدم هنا يقلل من الضرر المفرط نقص الأكسجة أثناء إعداد شرائح فرس النهر الماوس الشيخوخة والشيخوخة، وبالتالي إزالة عقبة رئيسية لدراسة وظيفة الدوائر العصبية ناضجة والشيخوخة. يؤدي إدخال انخفاض حرارة الجسم في حلول الصوديوم الحرة إلى شرائح فرس النهر التي تكون صحية لمدة تصل إلى 10 ساعات بعد القطع ومناسبة لكل من التسجيلات الميدانية طويلة الأجل ودراسات المشبك. هذه الطريقة لإعداد شرائح فرس النهر يمكن أن تكون ذات صلة خاصة لنماذج الحيوانات في الأمراض العصبية التي تتطلب بحكم التعريف إعداد الدماغ الشيخوخة.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إدخال انخفاض حرارة الجسم عن طريق إسراف عبر القلب مع محلول الجليد الباردة. مع بعض الممارسة، سوف يكون الباحثون قادرين على تنفيذ هذه الخطوة بشكل موثوق. تبدأ من خلال إعداد لتر واحد من حل ACSF لغرفة الانتعاش والتسجيلات اللاحقة.
ثم إعداد 300 ملليلتر من NMDG-ACSF لإسراف عبر القلب وخطوات القطع. ضع علبة القطع المجهرية المهتزة والقرص المتصاعد في ثلاجة ناقص 20 درجة مئوية. لإعداد غرفة الاسترداد، تعبئة إلى ما يزيد قليلا على شريحة عقد شبكة والبدء في فقاعة حفظ الغرفة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
هدئ 300 ملليلتر كامل من NMDG-aCSF في ثلاجة حتى تبدأ بلورات الثلج في التشكل على السطح وجدران الزجاجة. ضع الزجاجة مع المبردة و NMDG-aCSF على الجليد والفقاعة، والحفاظ على الحل بين صفر واثنين من درجات مئوية. أخرج قرص الأنسجة المتصاعد من الفريزر وامسحه جافًا، إذا لزم الأمر.
قطع كتلة من 5 ٪ أجار حول حجم دماغ الماوس والغراء في وسط القرص باستخدام طبقة رقيقة من الغراء سيانوكرايل. ضع القرص مع أجار لاصقة على الجليد وتغطيته بالمناشف الورقية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. أخرجي صينية القطع من الفريزر، وضعها في الميكراتوم، ثم أحاطه بالثلج وحمّل النصل.
إعداد جميع الأدوات في وقت مسبق لتشريح الدماغ. إعداد مضخة ال peristaltic ل perfusion عبر القلب. أدخل جانبًا واحدًا من أنابيب المضخة في الزجاجة باستخدام NMDG-aCSF المثلج وتناسب الجانب الآخر بإبرة قياس 27.
تعيين سرعة المضخة إلى حوالي 3.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. بهذه السرعة، فإن تدفق NMDG-aCSF هو رحلة سريعة، وليس تدفق مستمر. ضع الماوس على ظهره على حفاضة.
قبل الاستمرار، وأكد أن الماوس هو في طائرة جراحية من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع قدم. يجب أن يكون الماوس لا يستجيب ، ثم يتم تسجيله أسفل ساقيه الأماميتين والذريتين بحيث يتعرض الصدر والبطن. قطع رقعة كبيرة من الجلد على الصدر، والذهاب من تحت القص إلى الحلق.
الاستيلاء على القص مع ملقط، ورفعه بلطف والبدء في قطع من خلال القفص الصدري على كلا الجانبين حتى يتم الكشف عن تجويف الصدر. قطع من خلال الحجاب الحاجز، وترك رفرف القفص الصدري تعلق عن طريق قطعة رقيقة من العضلات. وينبغي أن يكون من الممكن وضعها جانبا دون أن يكون لها تقع مرة أخرى على تجويف الصدر المكشوفة.
تأكد من أن القلب لا يزال ينبض وتأكد من أن معظم الكبد مرئي. أدخل الإبرة في البطين الأيسر، الذي يبدو أخف لونًا من اللون الأيمن. لتثبيت الإبرة، محركها من خلال الأضلاع المتبقية على الجانب الأيسر من الجسم.
حدد مكان الأذين الأيمن الداكن ذو اللون الأحمر ويقطعه بمقص صغير. يجب أن يبدأ الدم بالتدفق بدء المضخة ومراقبة الكبد، والتي سوف تغير اللون من الأحمر إلى البني.
مراقبة لون الكبد ومواصلة الانفعال حتى يتحول الكبد البني شاحب. تشغيل المضخة لبضع دقائق أخرى. يجب أن تنخفض درجة حرارة الجسم من الحيوان إلى 28 إلى 29 درجة مئوية وأنفها يجب أن يكون باردا لمسة.
قطع رأس الماوس مع مقص قطع الرأس كبيرة، ثم استخدام مشرط مع شفرة رقم 10 لقطع فتح الجلد على رأس الجمجمة. مع مقص صغير الزاوية، وقطع الجمجمة في خط الوسط. بعد ذلك ، استخدم عدد ثلاثة ملقط لابعاد النصفين الأيمن والأيسر من الجمجمة ، مع الحرص على اتخاذ دورا بعيدا معها.
إزالة الدماغ، والتي ينبغي أن يكون لون أبيض من قبل يغرف بها مع ملعقة وإسقاطه في حل NMDG-aCSF على الجليد. اتركه هناك لمدة تصل إلى دقيقة. أخرج الدماغ من NMDG-aCSF وضعه على قطعة من ورق التصفية.
قطع وإزالة إسفين 60 درجة من الأنسجة مع أداة 60 درجة تركزت في خط الوسط من نهاية الرسترالية من forebrain. استخدام الجانبين قطع من سطح تصاعد كما أنه يوفر زاوية مناسبة لشرائح فرس النهر. فصل نصفي الكرة الأرضية أسفل خط الوسط مع مشرط واللصق لهم على القرص المتصاعد.
خذ القرص المتصاعد من الجليد وامسحه جافًا ، إذا لزم الأمر. ثم الغراء كل نصف الكرة أمام كتلة أجار، وقطع الجانب إلى أسفل. تأكد من أن الجانبين البطنيين لكلا نصفي الكرة الأرضية تلامس كتلة أجار وأن الجانبين الظهريين لكلا نصفي الكرة الأرضية تواجه النصل.
عندما لصقها على الجانب قطع، ينبغي أن يكون موجها كل نصف الكرة الأرضية بالنسبة إلى شفرة بطريقة تضمن شرائح عرضية من الحصين الظهرية في الموقع. غمر القرص مع نصفي الكرة الأرضية في غرفة القطع التي تحتوي على الجليد الباردة carbdG-aCSF. قطع قسم 400 ميكرومتر، ثم استخدام ماصة نقل المتاح مع طرف قطع لنقل شريحة إلى غرفة الانتعاش التي تحتوي على NMDG-aCSF carbogenated في درجة حرارة الغرفة.
مواصلة قطع بقية المقاطع ونقلها إلى غرفة الإنعاش لا تستغرق أكثر من 10 دقائق لقطع ما مجموعه ثماني إلى 10 شرائح من منطقة الحصين الظهرية. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تقريبا قبل التسجيل. تم استخدام هذا البروتوكول لتوليد شرائح فرس النهر من الفئران البالغة.
تظهر أعداد كبيرة من الخلايا الهرمية في حقل CA1 و subiculum في تباين منخفض ، وهي سمة مميزة للخلايا السليمة ، عندما لوحظ تحت المجهر التفاضلي للتباين تحت الحمراء. يمكن الحصول على تسجيلات التصحيح المشبك من الخلايا العصبية CA1 من الفئران التي هي أكثر من ستة أشهر من العمر. في التجربة المثال هنا، تم قياس تردد التيارات ما بعد التشنج مصغرة بعد تم حث NMDA-LTD نسبة إلى ظروف التحكم.
وكان تواتر مصغرة التيارات بعد الإثارة أقل في الخلايا العصبية بعد التعريفي NMDA-LTD، مما يشير إلى النشاط تعتمد تقليم من synopses في CA1. ولم يتم الكشف عن تغيرات في السعة. خلال تسجيلات mEPSC، كما تم شغل خلايا CA1 biocytin وarbor dendritic سليمة ويمكن رؤية عادة الخلايا الصحية من الخلايا العصبية الهرمية هنا.
يتيح التوزيع القوي للصبغة الفلورية في جميع أنحاء الخلية تحليل التشعبات والعمود الفقري التشعبي في ظل ظروف مختلفة. لوحظت التقوية طويلة الأجل، أو LTP، من نقاط الاشتباك العصبي CA3-CA1 من حوالي 170٪، مما يشير إلى أن الحفاظ على الشلالات الإشارات اللازمة لLTP موجودة في شرائح أعدت من الفئران البالغة. تشير إشارة محتملة قوية إلى وجود حقل مثير للإثارة إلى أنه تم الحفاظ أيضًا على اتصال الشبكة.
جانبان حاسمان للبروتوكول هما الإسراف عبر القلب مع محلول الجليد البارد للحث على انخفاض حرارة الجسم وإدخال NMDG كبديل أيون الصوديوم في حلول لمنع الوذمة السامة للخلايا. باستخدام هذه الاحتياطات، يمكن إعداد شرائح حادة من أي منطقة الدماغ. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام شرائح أعدت بهذه الطريقة للكالسيوم والجهد التصوير باستخدام المجهر 2-فوتون أو widefield.
ويمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس لإعداد موحد لشرائح قرن آمون حادة من الحيوانات الشيخوخة وبالتالي تسهيل المقارنات عبر الدراسات في سياق آليات الأمراض العصبية التنكسية.
