يمكن أن يوفر مقايسة مسطرة الحمض النووي المزدوج رؤى ميكانيكية لإعادة توزيع الريبوسوم وتحقيق عمليات تهجير أخرى من حمض النوويات. لدينا اختبار حاكم الحمض النووي المزدوج حاليا هو الطريقة الوحيدة التي يمكن أن تحقق موضوعيا على حد سواء الجانبين مدخل والخروج من مرنا في مجمعات الريبوسوم مع قرار أحادي النيوكليوتيد. كما يتم تطبيق أساليب مماثلة لقياس قوة الحمض النووي الملزمة وانتقائية الأدوية العلاجية الكيميائية.
عرض مرئي للأسلوب هو فرصة جيدة بالنسبة لنا لإظهار مزايا حدسي لدينا تقنية ومساعدة الباحثين الآخرين على مزيد من تطويرها إلى مزيد من التطبيقات. للبدء، جعل عينة بلاستيكية جيدا مع شريط الستايرين عن طريق حفر مكعب في المركز مع أبعاد أربعة ملليمترات من ثلاثة ملليمترات من مليمترين. ثم، باستخدام الايبوكسي، الغراء قطعة من الزجاج المغلفة البيوتين، من حوالي خمسة ملليمترات طويلة، إلى السطح السفلي.
إضافة 20 ميكرولترات من 0.25 ملليغرام لكل ملليلتر streptavidin محلول مائي في العينة جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم شطف العينة جيدا مرتين مع المخزن المؤقت TAM10. لشل حركة مجمعات الريبوسوم دون المضادات الحيوية، أولا إزالة العازلة من العينة جيدا، وإضافة 20 ميكرولترات من 0.1 ميكرومولر MF-Pre أو MF-Post مجمع الريبوسوم في العينة جيدا.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم شطف مرة واحدة مع المخزن المؤقت TAM10. يرتبط مجمع الريبوسوم الآن مع streptavidin على السطح عبر البيوتين نهاية خمسة رئيس على مرنا. للتجربة باستخدام المضادات الحيوية، احتضان تسعة ميكرولترات من مجمع MF-Pre مع ميكرولتر واحد من أربعة ملليمولار نيوميكيسين، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم الجمع في أنبوب 0.6 ميكرولترات من 60 EFG micromolar، 0.8 ميكرولترات من 100 GTP micromolar, 0.8 ميكرولترات من 100 ملليمتر PEP, 0.3 ميكرولترات من 1.3 ملليغرام لكل ملليلتر بيروفات كيناز, 6.43 microliters TAM10 العازلة, وميكرة واحدة من حمض fusidic 5 ملليمتر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم الجمع بين خليط اثنين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.
إجراء تجارب المضادات الحيوية الأخرى بالمثل، مع تركيزات 0.2 ملليمولار فيوميسين، 0.4 ميليمولار هيغروميوسين B، و 0.25 حمض fusidic ميليمولار. بالنسبة لدراسة تغيير الإطار، كرر حضانة مجمعات MFNF-Pre التي تتضمن الزلق، U6A. وتشمل المضادات الحيوية من حمض fusidic بالإضافة إلى النيومايسين.
ويلزم وقت كاف لضمان إتمام عملية التهجين. وينصح أيضا لاستخدام العازلة TAM10 مع كلوريد الصوديوم الخلد واحد الفعلية للحفاظ على نظام homosteady. بعد الحضانة، وإزالة العازلة من العينة جيدا.
إضافة 20 ميكرولترات من واحد micromolar biotinylated الغوص الحمض النووي حبلا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في الصباح، شطف شكلت الحمض النووي / مرنا المزدوج مرة واحدة مع المخزن المؤقت TAM10. إزالة المخزن المؤقت من نموذج جيداً.
ثم إضافة 20 ميكرولترات من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في العينة جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بإدخال العينة بعناية في حامل، ووضعها في جهاز طرد مركزي لإزالة الجسيمات المغناطيسية الحرة من السطح بمعدل 84 مرة ز لمدة خمس دقائق. تشغيل الليزر.
ثم اضغط على زر الطاقة. ضبط حساسية ل 500 millivolts، وانتظر لمدة ساعتين تقريبا لتسخين وتثبيت المغنطيسية الذرية. لإعداد مقياس المغنطيسية الذري، قم بتشغيل برنامج التحكم في الجهاز، وإعداد وضع نقل المحرك إلى Noise والوضع الافتراضي إلى الصفر.
اضغط على قفل على اللوحة الأمامية. ضبط حساسية مرة أخرى إلى 200 ميليفولت. ضبط التيار والجهد من الليزر، والعثور على ذروة الرنين المناسبة ومستوى إشارة إلى الضوضاء للحصول على أفضل دقة إشارة.
اضغط على اكتساح على اللوحة الأمامية. تأكد من أن نسبة السعة إلى العرض فوق 0.5 وقيمة المرحلة أصغر من خمس درجات مع عرض أقل من 170 هرتز. سد العجز في إخراج آخر SR530 قفل في مكبر للصوت لردود الفعل من الليزر لقفل تردده.
سد العجز في مولد الدالة ATF20B لإدخال موجة مربعة من 500 ميليفولت الذروة إلى الذروة، 100 millihertz كإشارة مرجعية لتحويل التيار إلى إشارة مغناطيسية. ثم افصل مولد الدالة. قم بإعداد وضع نقل المحرك إلى الوضع في الاتجاهين والوضع الافتراضي إلى 260 ملليمتر.
تحقق من حالة وحدة تحكم درجة الحرارة، لضمان درجة الحرارة في حوالي 37 درجة مئوية، من جهاز الاستشعار الذري. تحقق من استقرار النظام بأكمله مرتين عن طريق تشغيل البرنامج مباشرة دون تحميل عينات لقياس إشارات حامل العينة الفارغة. لمغنطة العينات، واستخدام بلطف ملاقط لإخراج العينة من حامل، ووضع على مرحلة مغنطة لمدة دقيقتين.
ثم ضع العينة مرة أخرى في حامل العينة، والطرد المركزي في 335.4 مرات ز لمدة 20 دقيقة. إزالة الجسيمات المغناطيسية غير محددة. قم بتحميل العينة التالية على المحرك مع ملاقط.
انقر فوق قفل على اللوحة الأمامية لتشغيل البرنامج. وفي الوقت نفسه استخدام ملاقط لتحميل عينة أخرى في حامل، ووضعها في جهاز الطرد المركزي. جعل الجانب الزجاجي المطلي في مركز جهاز الطرد المركزي، وبدء الطرد المركزي في 335.4 مرات ز لمدة أربع دقائق.
عندما يعود المحرك إلى الصفر، بعد خمس دقائق تقريبًا، انقر فوق حفظ على اللوحة الأمامية. استخدم ملاقط بعناية لنقل عينة واحدة من المحرك إلى حامل جهاز الطرد المركزي. تطبيق قوة أقوى عن طريق زيادة سرعة الطرد المركزي من قبل 100 دورة في الدقيقة أو حجم خطوة مماثلة.
تبادل العينة للطرد المركزي. عملية بالتناوب لزيادة القوة تدريجيا في كل مرة. يتم الحصول على طيف قوة كاملة بعد 10 إلى 12 نقطة بيانات.
عند الانتهاء من جميع التجارب المخطط لها، قم بإيقاف تشغيل المعدات، والإجراءات في ترتيب عكسي كما تم تشغيلها. إزالة العينات من حامل، وتزج بها في الإيثانول لتنظيف واستخدامها في المستقبل. تنظيف حامل العينة مع الأسيتون في حالة التلوث حبة المغناطيسي.
في هذا البروتوكول، تم شل عمل مجمع الريبوسوم على السطح، عبر نهاية الخمسة وزراء من مرنا، وجعل كلا من خمسة prime و ثلاثة prime الجانب يسهل الوصول إليه لحكام الحمض النووي التحقيق. عندما كان الرابط للجانب خمسة prime أطول من 50 thymine ، تم الكشف عن إشارة مغناطيسية قوية ، مما يشير إلى تكوين ناجح للحمض النووي / مرنا دوبليكس. من خلال تغيير عدد النيوكليوتيدات على الحمض النووي، تم تحقيق ارتباط قوة الانفصام بطول مزدوج لالجوانب الثلاثة الرئيسية وخمسة رؤساء، على التوالي.
تظهر نتائج النقل الطبيعي من MF-Pre إلى MF-Post ، في غياب المضادات الحيوية ، أن الريبوسوم تحرك بواسطة ثلاث نيوكليوتيدات باتجاه الطرف الثلاثي على كلا الجانبين. MF-Pre حمل متشرد fMet-tRNA والفينيلالانين-رن في موقع P و A, على التوالي, في حين نفذت MF-Post fMet-tRNA والفينيلالانين-رن في موقع E و P, على التوالي, مع موقع شاغر A. ومع ذلك، عندما كانت كل من حمض الفوسيد والمضادات الحيوية adiomycin موجودة، انتقلت الريبوسوم بواسطة نوكليوتيد واحد فقط في الجانب خمسة رئيس ولكن اثنين من النيوكليوتيدات في الجانب ثلاثة رئيس.
بعد غسل المضادات الحيوية ، حدث النقل الطبيعي ، كما يتضح من ثلاث حركات نووكليوتيد من كل من الجانبين الخمسة وثلاثة رؤساء الوزراء. عند مغنطة العينة، يجب أن يقترب السطح المطلي ويترك المغناطيس عمودياً. وإزالة الجسيمات المغناطيسية غير محددة محددة جداً مهمة لدقة البيانات وجودتها.
توفر تقنيتنا دقة عالية وطريقة قابلة للتطبيق بشكل عام للتحقيق في النزوح الجزيئي للحمض النووي الذي يصادف على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية.
