Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

Der Dual-DNA-Lineal-Assay kann mechanistische Erkenntnisse für ribosometranslokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen. Unser Dual-DNA-Lineal-Assay ist derzeit die einzige Methode, die sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA in den Ribosom-Komplexen mit Single-Nukleotid-Auflösung objektiv untersuchen kann. Ähnliche Methoden werden auch angewendet, um die DNA-Bindungsfestigkeit und Selektivität von chemotherapeutischen Medikamenten zu messen.

Die visuelle Demonstration der Methode ist eine gute Chance für uns, die Vorteile unserer Technik intuitiv aufzuzeigen und anderen Forschern zu helfen, sie zu weiteren Anwendungen zu entwickeln. Zunächst eine Kunststoffprobe mit einem Styrolstreifen gut zu machen, indem Sie einen Würfel in der Mitte mit Abmessungen von vier Millimetern mal drei Millimetern mal zwei Millimeterbohren bohren. Dann, mit Epoxid, kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas, von etwa fünf Millimetern lang, auf die untere Oberfläche.

20 Mikroliter 0,25 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-Wässerlösung in die Probe geben und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann spülen Sie die Probe zweimal mit TAM10-Puffer gut ab. Um die Ribosom-Komplexe ohne Antibiotika zu immobilisieren, entfernen Sie zunächst den Puffer aus der Probe gut und fügen Sie 20 Mikroliter 0,1 Mikromolar MF-Pre oder MF-Post Ribosom-Komplex in die Probe gut.

Bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren und dann einmal mit TAM10-Puffer abspülen. Der Ribosom-Komplex bindet nun mit dem Streptavidin an der Oberfläche über das Fünf-Prim-Ende-Biotin auf der mRNA. Für das Experiment mit Antibiotika, inkubieren neun Mikroliter des MF-Pre-Komplexes mit einem Mikroliter von vier Millimolar Neomycin, 37 Grad Celsius für 10 Minuten.

Dann kombinieren In einem Rohr 0,6 Mikroliter 60 Mikromolar EFG, 0,8 Mikroliter von 100 Mikromolar GTP, 0,8 Mikroliter von 100 Millimolar PEP, 0,3 Mikroliter von 1,3 Milligramm pro Milliliter Pyruvatkinase, 6,43 Mikroliter TAM10 Puffer, und ein Mikroliter von fünf Millimolar Fusidinsäure. Bei 37 Grad Celsius 20 Minuten inkubieren. Dann kombinieren Sie die beiden Mischungen, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für weitere fünf Minuten.

Führen Sie die anderen Antibiotika-Experimente ähnlich durch, mit Konzentrationen von 0,2 Millimolar-Viomycin, 0,4 Millimolar-Hygromycin B und 0,25 Millimolar-Fusidinsäure. Für Frame-Shifting-Studie, wiederholen Sie die Inkubation für die MFNF-Pre-Komplexe mit dem rutschigen Motiv, U6A. Enthalten Antibiotika von Fusidinsäure plus Neomycin.

Um den Abschluss des Hybridisierungsprozesses zu gewährleisten, ist ausreichend Zeit erforderlich. Es wird auch empfohlen, den TAM10-Puffer mit einem Mol-Natriumchlorid zu verwenden, um ein homostabiles System aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie nach der Inkubation den Puffer aus der Probe.

Fügen Sie 20 Mikroliter eines mikromolaren biotinylierten DNA-Strangs hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur über Nacht. Am Morgen spülen Sie die gebildete DNA/mRNA-Duplex einmal mit TAM10-Puffer. Entfernen Sie den Puffer aus dem Sample-Brunnen.

Dann 20 Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-beschichtete Magnetperlen in die Probe geben und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang brüten. Danach die Probe vorsichtig in einen Halter geben und in eine Zentrifuge legen, um die freien magnetischen Partikel bei 84 mal g für fünf Minuten von der Oberfläche zu entfernen. Schalten Sie den Laser ein.

Drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste. Stellen Sie die Empfindlichkeit auf 500 Millivolt ein, und warten Sie etwa zwei Stunden, um das Atommagnetometer aufzuwärmen und zu stabilisieren. Um das Atommagnetometer einzurichten, führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus, und richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Rauschen und Die Standardposition auf Null ein.

Drücken Sie die Sperre auf der Vorderseite. Stellen Sie die Empfindlichkeit wieder auf 200 Millivolt ein. Passen Sie den Strom und die Spannung des Lasers an, und finden Sie die richtige Resonanzspitze und den Signal-Rausch-Pegel für die beste Signalauflösung.

Drücken Sie Sweep auf der Frontplatte. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Amplitude zu Breite über 0,5 liegt und der Phasenwert kleiner als fünf Grad mit einer Breite von weniger als 170 Hertz ist. Schließen Sie den Ausgang eines anderen SR530-Verriegelungsverstärkers an die Rückmeldung des Lasers an, um seine Frequenz zu sperren.

Plug-in-Funktion-Generator ATF20B, um eine quadratische Welle von 500 Millivolt Peak bis Peak, 100 Millihertz als Referenzsignal für die Umwandlung von Strom in magnetisches Signal eingeben. Trennen Sie dann den Funktionsgenerator. Richten Sie den Bewegungsmodus Motor auf Zwei-Wege- und Standardposition auf 260 Millimeter ein.

Überprüfen Sie den Status des Temperaturreglers, um sicherzustellen, dass die Temperatur bei etwa 37 Grad Celsius des Atomsensors liegt. Überprüfen Sie die Stabilität des gesamten Systems zweimal, indem Sie das Programm direkt ausführen, ohne Proben zu laden, um die Signale des leeren Probenhalters zu messen. Um die Proben zu magnetisieren, verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um die Probe aus dem Halter zu nehmen, und legen Sie sie für zwei Minuten auf die Magnetisierungsstufe.

Dann die Probe wieder in den Probenhalter geben und 20 Minuten lang bei 335,4 mal g zentrieren. Entfernen Sie die nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel. Als nächstes die Probe mit einer Pinzette auf den Motor laden.

Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit eine Pinzette verwenden, um eine weitere Probe in den Halter zu laden, und legen Sie sie in die Zentrifuge. Machen Sie die beschichtete Glasseite zur Mitte der Zentrifuge und starten Sie die Zentrifugation bei 335,4 mal g für vier Minuten.

Wenn der Motor wieder auf Null kommt, klicken Sie nach etwa fünf Minuten auf Die Frontplatte speichern. Verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um eine Probe vom Motor auf den Zentrifugenhalter zu übertragen. Wenden Sie eine stärkere Kraft an, indem Sie die Zentrifugalgeschwindigkeit um 100 U/min oder eine ähnliche Schrittgröße erhöhen.

Tauschen Sie die Probe gegen die Zentrifuge aus. Prozess abwechselnd, um die Kraft jedes Mal schrittweise zu erhöhen. Nach 10 bis 12 Datenpunkten wird ein komplettes Kraftspektrum erreicht.

Wenn alle geplanten Experimente abgeschlossen sind, schalten Sie die Ausrüstung aus und gehen Sie in umgekehrter Reihenfolge vor, als sie eingeschaltet wurde. Entfernen Sie die Proben aus dem Halter und tauchen Sie sie zur Reinigung und zukünftigen Verwendung in Ethanol ein. Reinigen Sie den Probenhalter bei magnetischer Perlenkontamination mit Aceton.

In diesem Protokoll wurde der Ribosom-Komplex an der Oberfläche über das Fünf-Prim-Ende der mRNA immobilisiert und machte sowohl die Fünf-Prim- als auch die Drei-Prim-Seite für die sondierungen DNA-Herrscher leicht zugänglich. Wenn der Linker für die Fünf-Prim-Seite länger als 50 Thymin war, wurde ein starkes magnetisches Signal entdeckt, das auf eine erfolgreiche Bildung von DNA/mRNA-Duplexen hindeutet. Durch Variation der Anzahl der Nukleotide auf der DNA wurde die Korrelation von Dissoziationskraft mit Duplexlänge für die Drei-Prim- bzw. Fünf-Prim-Seiten erreicht.

Die Ergebnisse der normalen Translokation von MF-Pre zu MF-Post, in Ermangelung von Antibiotika, zeigen, dass das Ribosom durch drei Nukleotide in Richtung der Drei-Prim-Ende auf beiden Seiten bewegt. MF-Pre trug eine vagrante fMet-tRNA und Phenylalanin-tRNA an den P- bzw. A-Standorten, während MF-Post fMet-tRNA und Phenylalanin-tRNA an den E- bzw. P-Standorten mit einem freien A-Standort trug. Wenn jedoch sowohl Fusidinsäure als auch Adiomycin-Antibiotika vorhanden waren, bewegte sich das Ribosom nur um ein Nukleotid an der Fünf-Prim-Seite, aber um zwei Nukleotide an der Drei-Prim-Seite.

Nach dem Abwaschen der Antibiotika kam es zu einer normalen Translokation, wie drei Nukleotidbewegungen sowohl von der Fünf-Prime- als auch der Drei-Prim-Seite belegen. Beim Magnetisieren der Probe sollte sich die beschichtete Oberfläche nähern und den Magneten vertikal verlassen. Und das Entfernen der nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel ist sehr wichtig für die Datengenauigkeit und -qualität.

Unsere Technik bietet eine hohe Auflösung und eine allgemein anwendbare Möglichkeit, die molekulare Verschiebung von Nukleinsäure zu untersuchen, die in der Molekularbiologie weit verbreitet ist.