二重DNA定規アッセイは、リボソーム転座の機械学的洞察を提供し、他の核酸変位を探査することができる。当社の二重DNA定規アッセイは、現在のところ、単一ヌクレオチド分解能を有するリボソーム複合体中のmRNAの入口側と出口側の両方を客観的に探査できる唯一の方法です。同様の方法は、DNA結合強度および化学療法薬の選択性を測定するためにも適用される。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、私たちの技術の利点を直感的に示し、他の研究者がより多くのアプリケーションにそれを開発するのを助ける良い機会です。まず、4ミリメートル×3ミリメートル×2ミリメートルの寸法で中心に立方体を掘削することにより、スチレンストリップでプラスチックサンプルをうまく作ります。次に、エポキシを使用して、長さ約5ミリメートルのビオチンコーティングガラスを底面に接着する。
サンプルウェルに1ミリリットルのストレプトアビジン水溶液あたり0.25ミリグラムの20マイクロリットルを加え、室温で40分間インキュベートします。次に、TAM10 バッファーでサンプルを十分に 2 回リンスします。抗生物質を使わずにリボソーム複合体を固定するには、まずサンプルウェルからバッファーを取り出し、0.1マイクロモルMF-PreまたはMF-Postリボソーム複合体の20マイクロリットルをサンプルウェルに加える。
37°Cで1時間インキュベートし、TAM10バッファで1回リンスします。リボソーム複合体は現在、mRNA上の5素端ビオチンを介して表面上のストレプトアビジンと結合する。抗生物質を用いた実験では、MF-Pre複合体の9マイクロリットルを4ミリモルネオマイシンの1マイクロリットル、摂氏37度で10分間インキュベートする。
その後、チューブ0.6マイクロモルEFG、0.8マイクロモルGTPの0.8マイクロリットル、100ミリモルPEPの0.8マイクロリットル、ミリリットルピルビン酸キナーゼあたり1.3ミリグラムの0.3マイクロリットル、6.43マイクロリットルTAM10バッファー、および5ミリモラットル酸の1マイクロリットルに組み合わせます。摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、2つの混合物を組み合わせ、さらに5分間摂氏37度でインキュベートします。
同様に、0.2ミリモルビオマイシン、0.4ミリモルハイグロマイシンB、および0.25ミリモルフジジンの濃度を有する他の抗生物質実験を行う。フレームシフトスタディでは、滑りやすいモチーフであるU6Aを含むMFNF-Pre複合体のインキュベーションを繰り返します。フジジン酸とネオマイシンの抗生物質を含む。
ハイブリダイゼーションプロセスの完了を確実にするために十分な時間が必要である。また、TAM10 バッファーと実際の 1 モル塩化ナトリウムを使用して、ホモステディシステムを維持することをお勧めします。インキュベーション後、サンプルからバッファーをうまく取り除きます。
DNA鎖を1マイクロモルビチン化プローブの20マイクロモルリットルを加え、室温で一晩インキュベートします。朝、形成されたDNA/mRNA二重鎖をTAM10バッファーで一度リンスします。サンプルからバッファーを取り除きます。
その後、サンプルウェルに1ミリリットルのストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズあたり0.5ミリグラムの20マイクロリットルを加え、室温で2時間インキュベートします。その後、慎重に試料をホルダーに入れ、遠心分離機に入れ、84回gの表面から5分間自由な磁性粒子を取り除きます。レーザーの電源を入れます。
次に、電源ボタンを押します。感度を500ミリボルトに調整し、約2時間待って原子磁力計を温めて安定化させます。原子磁力計を設定するには、計器制御ソフトウェアを実行し、モーター移動モードをノイズに設定し、デフォルトの位置をゼロに設定します。
フロントパネルのロックを押します。感度を200ミリボルトに戻します。レーザーの電流と電圧を調整し、最適な信号分解能を得るために適切な共振ピークと信号対雑音レベルを見つけます。
フロントパネルのスイープを押します。振幅対幅比が 0.5 を超え、位相値が 5 度未満で幅が 170 ヘルツ未満であることを確認します。別のSR530ロックインアンプの出力をレーザーのフィードバックに差し込み、周波数をロックします。
機能発生器ATF20Bを差し込み、ピークに500ミリボルトの方形波を入力し、電流を磁気信号に変換するための基準信号として100ミリヘルツを入力する。次に、関数ジェネレーターを取り外します。モーター移動モードを双方向に設定し、デフォルトの位置を 260 ミリメートルに設定します。
温度コントローラの状態を確認し、温度が約37°C、原子センサであることを確認します。空のサンプルホルダの信号を測定するためにサンプルをロードすることなく、プログラムを直接実行することにより、システム全体の安定性を2回確認してください。サンプルを磁化するには、ピンセットを使用してサンプルをホルダーから取り出し、磁化ステージに2分間置きます。
その後、サンプルをサンプルホルダーに戻し、遠心分離機を335.4倍gで20分間入れます。非特異的に結合した磁性粒子を取り除きます。次に、ピンセットでサンプルをモーターに積み込みます。
プログラムを実行するには、フロントパネルの[ロック]をクリックします。一方、ピンセットを使用して別のサンプルをホルダーにロードし、遠心分離機に入れる。コーティングされたガラス側を遠心分離機の中心に向け、遠心分離を335.4倍のgで4分間開始します。
モータがゼロに戻ったら、約5分後にフロントパネルの[保存]をクリックします。ピンセットを慎重に使用して、1つのサンプルをモーターから遠心分離機ホルダーに移します。遠心速度を100rpmまたは同様のステップサイズで増加させることにより、より強い力を加えます。
サンプルを遠心分離機と交換します。毎回徐々に力を増やすために交互に処理します。完全な力スペクトルは10〜12のデータポイントの後に得られる。
計画された実験がすべて終了したら、機器の電源を切り、電源を入れた後の順序で進みます。サンプルをホルダーから取り出し、洗浄と今後の使用のためにエタノールに浸します。磁気ビーズ汚染の場合は、アセトンでサンプルホルダーをクリーンアップします。
このプロトコルでは、リボソーム複合体を、mRNAの5素数端を介して表面に固定化し、5素数側と3素数側の両方をプローブDNA定規のために容易にアクセスできるようにした。5素数側のリンカーが50チミンより長い場合、強い磁気シグナルが検出され、DNA/mRNA二重鎖の形成に成功したことを示す。DNA上のヌクレオチドの数を変化させることにより、三素側と5素数側について、解離力と二重長の相関がそれぞれ達成された。
抗生物質がない場合のMF-PreからMF-Postへの正常な転座の結果は、リボソームが両側の3素端末に向かって3ヌクレオチドによって移動したことを示す。MF-PreはPサイトとA部位でvagrant fMet-tRNAとフェニルアラニン-tRNAをそれぞれ運び、MFポストはEサイトとPサイトでfMet-tRNAとフェニルアラニン-tRNAをそれぞれ空いている。しかしながら、フジジン酸とアディオマイシン系抗生物質の両方が存在する場合、リボソームは5素数側では1ヌクレオチドのみで移動し、3素数側では2ヌクレオチドによって移動した。
抗生物質を洗い流した後、正常な転座が起こり、5素数側と3素数側の両方からの3つのヌクレオチド運動によって証明された。試料を磁化する場合、コーティングされた表面が近づいて磁石を垂直に残す必要があります。そして、非特異的に結合された磁性粒子を除去することは、データの正確性と品質にとって非常に重要です。
我々の技術は、分子生物学で広く遭遇している核酸の分子変位を調査するための高解像度と一般的に適用可能な方法を提供する。
