وأيد هذا العمل من خلال تمويل من وزارة الدفاع-البروستاتا برنامج أبحاث السرطان (W81XWH-12-1-0124)، U54CA143876 من المعهد الوطني للسرطان، وصندوق روبرت McCooey التناسلي الأورام البحوث. نود أن نشكر الدكتور Annarita لورنزو (قسم علم الأمراض) لتوفير الأجسام المضادة VE كادهيرين، والدكتور ماركو Seandel (قسم الجراحة) لتوفير HUVECs.

1. التثقيف HUVECs على Microslides لرصد التفاعلات CTC-البطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وشطف أول شريحة مجهرية، عرض قناة من 1 ملم مع برنامج تلفزيوني. بلطف معطف شريحة مجهرية مع 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل فبرونيكتين (المنحلة في برنامج تلفزيوني) باستخدام حقنة 1 مل يور للانغلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية شريحة مجهرية مع غطاء والحفاظ عليه داخل غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 30 دقيقة. الاستغناء بطء السائل في شريحة مجهرية يمنع تشكيل فقاعة في القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي 200 ميكرولتر من الحارة (37 درجة مئوية) HUVEC النمو المتوسطة (M199 وسائل الإعلام، 1M HEPES، 20٪ FBS، 5 ملغ / مل الهيبارين، وعامل نمو الخلايا البطانية 100 ميكروغرام / مل، والجلوتامين L-) على شريحة مجهرية واحتضان ل 20 دقيقة في RT. خلال نضح، وإعداد تعليق خلية HUVEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف HUVECs مع برنامج تلفزيوني وإضافة 0.05٪ التربسين EDTA-لمدة 1-2 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في 2 HUVECs المتوسطة النمو مل في 180 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الخلية باستخدام neubaعدادة الكريات اتحاد الاذاعات الأوروبية وإعداد 10 7 HUVEC cells/100 ميكرولتر النمو المتوسط. ثم، وإزالة بعناية متوسطة من مدخل لشريحة مجهرية باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب شريحة مجهرية لمستوى العين واستخدام 1 مل حقنة ليور للانغلاق، يروي بلطف 200 ميكرولتر من تركيز استعداد للHUVECs في القناة. الحذر مطلوب في هذه الخطوة لمنع تشكيل فقاعة. إذا ظهرت فقاعات، والحفاظ على perfusing لفترة أطول قليلا حتى فقاعات دخول قناة منفذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حجم مساو (~ 80 ميكرولتر) من وسائل الإعلام HUVEC في كل من مدخل ومخرج للشريحة مجهرية. هذا يمنع تدفق الخلايا في أي من الاتجاهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية شريحة وابقائه في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 1.5 ساعة. </li></ol> 2. إعداد تدفق الجمعية غرفة ليلة وضحاها HUVEC الثقافة على شريحة مجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقنة معقمة 20 مل، وموصلات يور الإناث والذكور، وأنابيب، وضخ حقنة في الحاضنة لمدة 15 ميلن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحد الأدنى من حجم القتلى، واستخدام أنابيب مع قطرها الداخلي 0.04 بوصة. أصغر قطرها أنابيب يمنع تشكيل فقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 20 مل مع دافئ (37 درجة مئوية) HUVEC وسائل الإعلام (12 مل). إرفاق أنابيب مع موصلات على حقنة. إزالة الفقاعات. ربط هذا التجمع إلى شريحة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء تماما مدخل لشريحة مجهرية مع وسائل الإعلام HUVEC. جلب شغل حقنة 20 مل تعلق على موصل بجانب شريحة مجهرية. نعلق بلطف موصل إلى شريحة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب مجموعة المتابعة في الحاضنة وتوصيله إلى ضخ حقنة، الغروب في 10 ميكرولتر / دقيقة معدل القص. ترك الخلايا O / N في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، تفكيك مجموعة المتابعة عن طريق إزالة موصل تعلق على مدخل لشريحة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لupregulate-E selectin التعبير على ECS، وإعداد متوسطة النمو الطازجة التي تحتوي على IL-1β في 10 نانوغرام / مل 4 مل في وسائل الإعلام. نضح في وسائل الإعلام حقنة 10 مل. إزالة روقال انه وسائل الاعلام من مدخل لشريحة مجهرية وتوصيل حقنة إلى الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ضخ حقنة في 10 ميكرولتر / دقيقة معدل القص لمدة 4 ساعة في الحاضنة. </li></ol> 3. إعداد مكافحة PSMA (J591-488) إعتبر خلايا سرطان البروستاتا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال IL-1β حضانة HUVECs، وإعداد مكافحة PSMA J591-alexa488 صفت الخلايا محكمة التحكيم الدائمة. إضافة 0.05٪ التربسين EDTA-MDA إلى الخلايا لمدة 1 دقيقة. لا تعرض الخلايا إلى التربسين لمرات أطول لأنها يمكن أن تؤثر على glycopeptides موجودة على سطح الخلية. ويمكن أيضا انزيم تفارق الخلية الحرة كاشف أن تستخدم بدلا من التربسين. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend MDA بيليه خلية في 1 مل H / H العازلة (هانكس الملح متوازن solution/0.1٪ HSA/10 ملي HEPES / 1 مم CaCl 2). إضافة مضادة للPSMA-J591 alexa488 الأجسام المضادة في 20 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة في RT في مكان مظلم. resuspend الخلايا أثناء الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي حل الخلية في 800 x ج لمدة 5 دقائق. ASPIمعدل و resuspend بيليه في 1 مل H / H العازلة. عد الخلايا MDA وصفت وجعل تركيز النهائي لالخلايا 1x10 6 / مل. ملء حقنة 5 مل مع J591-488 الخلايا MDA وصفت وإزالة الفقاعات. </li></ol> 4. إعداد مكافحة PSMA (J591-488) وصفت التدرجي المخصب من PCA المرضى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 7.5 ملليتر دم من مرضى سرطان البروستاتا في أنبوب الغطاء الأزرق (التي تحتوي على سترات الصوديوم). تمييع الدم برفق 01:01 في 0.1٪ BSA / 1 ملم EDTA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5.3 مل Ficoll-paque زائد في أنبوب مخروطي 50 مل. طبقة مخففة الدم على رأس ficoll-paque. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما قبل معطف جميع الأنابيب أو نصائح القادمة في اتصال مع التدرجي مع 2٪ FBS/RPMI-1640 / 1 مم CaCl 2/4 ملم MgCl 2 (R / S العازلة) لمنع غير محددة وملزمة من التدرجي إلى السطوح. 4 الحفاظ على درجة حرارة ° C وسائل الإعلام ومخازن القادمة في اتصال مع التدرجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحيطية وحيدات النوى الدم الخلية (PBMCs) جزءتحتوي التدرجي من واجهة في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل أخرى R / S العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية ويغسل مرة أخرى في R / S عازلة في 400 x ج لمدة 8 دقائق. بعد الطرد المركزي، resuspend وبيليه في H / H العازلة. إضافة مضادة للPSMA J591-488 الضد في 20 ميكروغرام / مل لمدة 30 دقيقة في RT في مكان مظلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي والتي تحتوي على PBMCs J591-488 التدرجي وصفت في 800 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في H / H العازلة. ملء حقنة 1 مل (المغلفة مسبقا مع R / S العازلة) مع العينة. </li></ol> 5. إعداد المجهر، مضخة المحاقن وتدفق الجمعية غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مجهر مقلوب وتعيين الإضاءة كولر في 10X الهدف. جلب ضخ حقنة في نفس مستوى المرحلة عينة من المجهر وضعه في 1 داين / سم 2 إجهاد القص (~ 10 ميكرولتر / دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج زايس Axiovision. تحديد الهدف على شاشة الكمبيوتر. إنشاء لجنة جديدةمجلد تحت خيار الأدوات في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الخيار التجارب الذكية في Axiovision وضبط الإعدادات لتسجيل مقاطع الفيديو القصيرة 30 ثانية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفيديو الفلورسنت الحية، وتعيين الخيارات-12 صورة ميللي ثانية التعرض، 2 × 2 بن، 5 صعود. هذه المعايير يساعد في تحقيق أشرطة الفيديو على مقربة من معدل إطار الفيديو (~ 23 لقطة في الثانية) مع الكاميرا زايس MRM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور العرض الكامل للقناة تدفق في 10 X الهدف على شاشة الكمبيوتر، واستخدام محول C-جبل (0.63 ملم واجهة xf/60). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مصباح الزئبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقنة والموصل التي تحتوي على الخلايا على ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب IL-1β حفز HUVECs من الحاضنة. إرفاق موصل إلى مدخل قناة شغل من شريحة مجهرية تحتوي على HUVECs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط قناة منفذ مع موصل تعلق على الأنابيب. وضع أنابيب في طبق أو 15 مل أنبوب مخروطي لجمع تدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء infusiعلى طريق شريحة مجهرية في 10 ميكرولتر / دقيقة. مراقبة التفاعلات بين الخلايا البطانية وخلايا MDA المسمى أو المسمى التدرجي المستمدة من المرضى تحت التصفية 488 نانومتر على المجهر epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تسجيل التجربة إلى 30 ثانية أشرطة الفيديو القصيرة. خلال تحليل التشغيل، وقياس سرعة المتداول. يتم قياس سرعة المتداول عن طريق قسمة المسافة التي تقطعها الخلايا مع مرور الوقت. </li></ol> 6. المناعية للشريحة مجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من مدخل ومخرج للشريحة مجهرية بعد perfusing الخلايا MDA على IL-حفز 1β HUVECs لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تلميح 200 ميكرولتر، وطرح دافئ (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم في مدخل لشريحة مجهرية لمدة 5 دقائق. إمالة شريحة مجهرية باستخدام غطاء لها كدعامة على مقاعد البدلاء. الحفاظ على شريحة مجهرية في موقف يميل لجميع حضانات خلال المناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح HUVECs بواسطة perfusing الحارة 2٪ الفورمالديهايد في مدخل </li><lط&gt; احتضان لمدة 20 دقيقة في RT. شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تريتون X-100 (0.1٪) في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. منع مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية الماعز المضادة للVE كادهيرين (1:100) في 2.5٪ BSA O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. إضافة حمار الثانوية المضادة للماعز 647 الضد لمدة 45 دقيقة. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند RT-J591 مع أنسنة alexa488 الضد مترافق لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. إضافة دابي لمدة 5 دقائق. يغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة برنامج تلفزيوني (أو mowiol للتخزين طويل الأجل). تصور شريحة مجهرية تحت المجهر متحد البؤر. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+in+transit:+the+vascular+interactions+of+tumor+cells.">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li><li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis.">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li><li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li><li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers.">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--/rag2--+mice.">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

الدكتور بندر هو مخترع على براءات الاختراع التي تم تعيينها لمؤسسة أبحاث كورنيل (&quot;CRF&quot;) للأجسام المضادة J591 المستخدمة في هذه المقالة. الدكتور بندر هو مستشار لوتملك الأسهم في BZL الحيوية، وهي الشركة التي تم ترخيص براءات الاختراع التي كتبها CRF لمزيد من البحث والتطوير.

ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد خلايا الدم بين التدرجي، فمن الصعب عزل التدرجي كما يبلغ عدد سكانها نقية من الخلايا. من أجل دراسة التفاعلات CTC / EC، السكان النادرة ونجس من التدرجي يطرح تحديين رئيسيين: أ) تحديد التدرجي بين خلايا الدم؛ ب) مراقبة التفاعلات CTC / EC. <p class="jove_content" style=";t...

ورم خبيث معقد عملية متعددة الخطوات التي لا تزال غير مفهومة تماما. وقد تبين محور يجند E-selectin/selectin للعب دورا هاما في الورم ورم خبيث من خلال تعزيز التفاعلات الأولية لاصقة بين بطانة الأوعية الدموية والخلايا السرطانية 1،2. البطانية (E)-selectin هو بروتين عبر الغشاء الذي أعرب عنه تنشيط الخلايا البطانية، في حين يتم التعبير عن مختلف يجند selectin E (ق) من قبل الخلايا السرطانية 3. وقد استخدمت العديد من النهج بنجاح في المختبر لنموذج التفاعلات يجند E-selectin/selectin بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية (ECS) 1. لدراسة هذه التفاعلات، يجري استخدام أنظمة مختلفة لمحاكاة غرفة تدفق الدم الأوعية الدموية. بين تدفق المجالس الغرفة، ويستخدم بشكل روتيني موازية لوحة غرفة تدفق (PPFC) بالتزامن مع ECS باعتباره محاكاة في المختبر في ظروف إجهاد القص الجسم الحي الطراز. في هذاتزرع الأسلوب، ECS على طبق 35 ملم وبعد تحقيق أحادي الطبقة، هي التي تعلق ECS إلى PPFC ويتم تنفيذ تجارب إجهاد القص القائمة. ومع ذلك، PPFC وغيرها من النظم الحالية تقديم الكثير من القيود لدراسة التفاعلات لاصقة بين الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي) المستمدة من المرضى وECS، في المقام الأول، لأن التدرجي هي نادرة السكان من الخلايا، تسلط من الورم الرئيسي، تعميم بين الملايين من خلايا الدم (1 CTC في 10 9 خلايا الدم) 4. وبالتالي، على عكس العرض غير محدود من خطوط الخلايا المستزرعة، التهم CTC منخفضة تؤدي إلى عدد قليل جدا ونادرة التفاعلات CTC / EC، تتطلب المناسبة عرض القناة تدفق لتسجيل لتحليل التفاعلات التشغيل. بالإضافة إلى ذلك، منذ المريض التدرجي المستمدة من السكان نجس، لذلك لا بد من وضع علامة تحديد لتتبع التدرجي بشكل خاص. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتحديد سرطان البروستاتا (PCA) CTخدمات العملاء من خلال الاستفادة من حقيقة أن جميع هذه التدرجي التعبير عن مستضد البروستات محددة غشاء (PSMA) على سطح الخلية الخاصة بهم 5،6. في هذا التقرير، استخدمنا خط الخلايا السرطانية في البروستاتا، MDA PCa2b (MDA)، للتدليل على فائدة محتملة من النظام الجديد لدينا لدراسة البروستاتا CTC التفاعل مع ECS، في نهاية المطاف إلى فهم آلية الانبثاث. منهجيتنا يمكن تطبيقها على مختلف التجارب القائمة على محاكاة القص في نظام الأوعية الدموية فيفو 7-9. بالإضافة إلى دراسة التفاعلات PCA CTC / EC، ونظام غرفة التدفق الحالي يمكن تكييفها بسهولة لتحليل خلايا الدم المحيطية أو تفاعلات الخلايا السرطانية &#39;مع ECS. سهولة تفكيك وإعادة تجميع للغرفة التدفق، وهي شريحة مجهرية الثالث (0.1) (ويشار إليه فيما بعد ب شريحة مجهرية)، ويسمح زراعة ECS تحت نضح وتحفيز ECS مع السيتوكينات المختلفة للحث على العلاقات العامةotein التعبير. الى جانب ذلك، مثقف ECS، البروتينات المؤتلف مثل E-وف selectin يمكن أن تطلى على شريحة مجهرية والتفاعل مع الخلايا السرطانية يمكن ملاحظتها تحت ظروف تدفق الصفحي 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

ورم خبيث هو العملية التي الخلايا السرطانية من الورم تسليط intravasate الوعائية الدموية الابتدائي والجهاز الليمفاوي، وبالتالي، الوصول إلى يتسرب وتشكيل مكانة ثانوية. وتسرب الخلايا السرطانية من الدم الأوعية الدموية يمكن دراستها باستخدام الخلايا البطانية (ECS) والخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من خطوط مختلفة من الخلايا. وأجريت الدراسات الأولية باستخدام ظروف ثابتة ولكنها قد تم توثيقه جيدا أن ECS تتصرف بشكل مختلف في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. لذلك، يتم استخدامها حاليا مختلف التجمعات غرفة التدفق لدراسة التفاعلات الخلايا السرطانية مع ECS. المجالس الحالية غرفة التدفق تقديم نتائج قابلة للتكرار سواء باستخدام خطوط مختلفة من الخلايا أو السوائل في مختلف ظروف إجهاد القص. ومع ذلك، لمراقبة ودراسة التفاعلات مع خلايا نادرة مثل الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي)، يطلب من بعض التغييرات التي ينبغي إدخالها على التجمع التقليدي غرفة التدفق. التدرجيهي السكان الخلية نادرة بين الملايين من خلايا الدم. وبالتالي، فمن الصعب الحصول على السكان نقية من التدرجي. تلوث التدرجي مع أنواع مختلفة من الخلايا التي توجد عادة في التداول أمر لا مفر منه باستخدام تقنيات تخصيب الحاضر أو ​​استنزاف. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة فريدة من نوعها لتسمية تعميم خلايا سرطان البروستاتا fluorescently ودراسة تفاعلاتها مع ECS في نظام غرفة التدفق الذاتي تجميعها. هذه التقنية يمكن تطبيقها كذلك لمراقبة التفاعلات بين التدرجي البروستاتا وأي بروتين من الفائدة.

ويبين الشكل 1 ثقافة O / N من أحادي الطبقة من ECS على شريحة مجهرية. وقشور على الشكل 1A تبين أن 100٪ من شريحة مجهرية غير مرئية باستخدام الهدف 5X بينما 70٪ غير مرئية باستخدام الهدف 10X (الشكل 1B). لE-selectin بوساطة التفاعلات، لا تعتبر خلايا المتداول عند الحواف...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells at JoVE

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

يصف تقريرنا طريقة فريدة لتصور وتحليل التفاعلات CTC / المفوضية الأوروبية في سرطان البروستاتا في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية.

في الطريقة المختبر لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K Views.  Weill Cornell Medical College.  يصف تقريرنا طريقة فريدة لتصور وتحليل التفاعلات CTC / المفوضية الأوروبية في سرطان البروستاتا في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. 

Video: In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الضمور العضلي المرضى: كفاءة خالية من التكامل إعادة برمجة الخلايا المستمدة البول

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

في التخصيب في المختبر من خلايا سرطان المبيض-الشروع ورم

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

جيل من سرطان البروستاتا المريض المشتقة نماذج طعم أجنبي من تعميم الخلايا السرطانية

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...