La capacité de quantifier les changements dans la morphologie des tissus et des organites est importante pour comprendre la fonction génétique ainsi que l’impact des mutations génétiques. Nos protocoles expliquent comment le logiciel librement disponible peut être employé pour évaluer non subjectivement la morphologie des synapses, des muscles, et des mitochondries dans un nématode, C.elegans. De nombreuses études antérieures se sont appuyées sur des méthodes qualitatives pour comparer les changements morphologiques.
Cependant, ceux-ci peuvent être problématiques car ils peuvent ne pas capturer des différences phénotypique subtiles, pourraient sursur et sous-estimer les changements, et sont évalués subjectivement. Nos méthodes quantitatives fournissent des moyens plus robustes et moins biaisés pour évaluer les changements morphologiques. Ces méthodes pourraient facilement être utilisées pour étudier les changements morphologiques dans d’autres structures cellulaires ou organismes modèles afin de définir la fonction génétique et les conséquences des mutations associées à la maladie.
Commencez par préparer des diapositives pour l’imagerie. Placez une goutte d’agarose fondue sur une lame de microscope et appuyez immédiatement sur la gouttelette avec une autre lame de microscope, aplatissant doucement l’agarose. Laissez sécher l’agarose pendant une minute, puis séparez soigneusement les deux glissières et laissez la garniture solidifiée sur l’une des glissières.
Placez la lame sur la scène du microscope et ajoutez une goutte d’anesthésique de 5 à 10 millilitres au centre de la garniture d’agarose. Utilisez un pic stérilisé à la chaleur pour transférer rapidement 10 à 15 animaux de la plaque de bouillon à la gouttelette anesthésique avant que la solution ne sèche. Appliquez ensuite un coverslip en le positionnant juste au-dessus de la garniture d’agarose et en le laissant tomber doucement vers le bas.
Imagez les régions synaptiques avec un microscope confocal à balayage en ligne couplé à un laser à diode semi-conducteur à pompe optique de 488 et 552 nanomètres et équipé d’un logiciel de capture d’image. Après avoir localiser les vers, passez à un grossissement 40X et appliquez un milieu d’immersion. Visualisez la région synaptique en excitant les fluorophores avec un laser de 552 nanomètres, 1% de puissance pour le fluorophore tagRFP, et 488 nanomètres, 2% de puissance pour le fluorophore GFP.
Capturez des images à l’aide d’un photodétecteur hybride et définissez les gains pour prévenir la surexposition des fluorophores. Collecter des images Z-stack pour couvrir l’ensemble de la synapse en utilisant la taille optimale Z-step en fonction de l’objectif. Pour analyser la région synaptique commencer par charger les images dans le logiciel CellProfiler 3.1.5.
Configurer le module NameAndType et déterminer la région synaptique par définition à la main à l’aide du tagRFP diffus exprimé à partir du transgène UIS-115. Mesurez la taille et la fluorescence de la synapse définie à la main en ajoutant les modules MeasureObjectSizeShape et MeasureObjectIntensity au pipeline. Calculez ensuite l’intensité relative intégrée de la fluorescence en ajoutant le module CalculateMath et en divisant les unités d’intensité intégrée obtenues à partir de JSIS37 par celles obtenues à partir de l’ISU-115.
Une fois terminé l’exportation toutes les mesures et les calculs. Pour mesurer la zone des cellules musculaires ouvrir l’image dans le logiciel Fidji et utiliser la sélection de polygones pour tracer soigneusement autour d’une seule cellule musculaire oblique. Ajustez la ligne du polygone à l’extrémité en faisant glisser le point d’ancrage pour améliorer le traçage.
Accédez à l’onglet Analyser en haut du logiciel et cliquez sur Mesurer pour calculer la zone sélectionnée. Pour les cellules musculaires ayant une région dégénérée ou manquante tracer la zone manquante avec l’outil de sélection du polygone et cliquez à nouveau mesurer. S’il y a plusieurs lacunes, tracez chacune d’elles séparément.
Calculer le rapport entre la zone d’écart et la zone de l’ensemble de la cellule. Un rapport élevé indique une plus grande étendue de dégénérescence musculaire. Et s’il n’y a pas de régions manquantes, le ratio est calculé comme zéro.
Ouvrez elastic et choisissez la classification pixel sous Créer un nouveau projet. Ensuite, renommez et enregistrez le projet. Accédez à l’onglet données d’entrée et cliquez sur Ajouter nouveau, puis Ajouter des images distinctes.
Dirigez la fenêtre contextée vers le dossier avec les fichiers TIF et sélectionnez l’image désirée. Dans l’onglet Sélection de fonctionnalités, cliquez sur Sélectionner les fonctionnalités pour sélectionner toutes les fonctionnalités pixel indiquées par les cases cochées vertes. La sélection de pixels dans cette étape est utilisée pour distinguer les différentes classes de pixels dans l’étape suivante.
Utilisez un panneau de formation pour faire la distinction entre les filaments de myosine exprimant le GFP et les antécédents indésirables. Cliquez sur Ajouter l’étiquette et griffonner les arrière-plans indésirables et les espaces entre les filaments pour commencer la formation classificateur. Ajoutez une deuxième étiquette, renommez-la en Filament et rôdez sur un certain nombre de filaments.
Cliquez sur Mise à jour en direct pour vous assurer que la classification a été effectuée correctement. Si nécessaire, ajouter plus de gribouillis pour affiner la formation. Une fois que le classificateur de formation a été effectué, rendez-vous sur le panneau d’exportation de prédiction et cliquez sur Choisir les paramètres d’image d’exportation avec des probabilités comme source.
Assurez-vous que les sous-régions découpées x et y sont cochées, et c est nonticked. Sélectionnez zéro et un comme valeurs de démarrage et d’arrêt pour c, et convertissez le type de données en 8 bits non signés. Cochez Renormalize, puis modifiez la vidéo du fichier de sortie en png, rebaptisant le fichier et l’annuaire comme vous le souhaitez.
Fermez la fenêtre Paramètres d’exportation et exportez l’image qui vient d’être segmentée. Ensuite, ouvrez le fichier png dans le logiciel Fidji. Ajustez le seuil de l’image à l’aide des paramètres par défaut et appliquez le plug-in de skeletonization, qui créera une table de résultats distincte.
Ce protocole a été utilisé pour explorer la fonction de l’acétyltransferase d’alpha-tubulin MEC-17 dans le développement de synapse. L’analyse quantitative des images des synapses postérieures/latérales de microtubule ou de PLM indique que la surexpression de MEC-17 perturbe la fonction normale de neurone. Par rapport aux animaux sauvages de contrôle de type surexprimant MEC-17 ont considérablement réduit les régions présynaptiques et l’intégrité synaptique.
Ces techniques ont également été utilisées pour analyser les modèles C.elegans de type Charcot-Marie-Tooth 2 ou CMT2 porteurs de mutations dans les gènes associés au CMT2. L’évaluation visuelle de la morphologie de muscle de mur de corps a indiqué une augmentation de 2,5 à 3,5 fois des défauts chez les animaux d’essai comparés au contrôle sauvage de type. Les animaux avec des mutations dans fzo-1 et unc-116 ont éprouvé la perte des striations de muscle, l’accumulation des débris cellulaires, et la dégénérescence de fibre de muscle.
Tandis que les animaux avec des mutations dans dyn-1 ont éprouvé sensiblement moins de défauts dans la morphologie de muscle. Les mutants fzo-1 et unc-116 ont montré une augmentation de cinq à six fois le rapport entre l’écart et la zone totale d’une seule cellule et une longueur moyenne de fibre considérablement plus courte par rapport aux animaux de type sauvage. Pour que des comparaisons soient faites entre les échantillons, il est important de déterminer les conditions les plus optimales pour l’acquisition d’images et de s’assurer que ces conditions sont utilisées de façon cohérente.
Ces techniques permettront aux chercheurs de comparer les changements morphologiques entre différents milieux génétiques et les approches quantitatives. Cela réduit la subjectivité et donc aider à améliorer la représentabilité des données générées.
