La capacità di quantificare i cambiamenti nella morfologia dei tessuti e degli organelli è importante per comprendere la funzione genica e l'impatto delle mutazioni genetiche. I nostri protocolli spiegano come il software liberamente disponibile possa essere utilizzato per valutare non soggettivamente la morfologia di sinapsi, muscoli e mitocondri in un nematode, C.elegans. Molti studi precedenti si sono basati su metodi qualitativi per confrontare i cambiamenti morfologici.
Tuttavia, questi possono essere problematici in quanto potrebbero non catturare sottili differenze fenotipiche, potrebbero superare e sottovalutare i cambiamenti e sono valutati soggettivamente. I nostri metodi quantitativi forniscono mezzi più robusti e meno distorti per valutare i cambiamenti morfologici. Questi metodi potrebbero essere facilmente utilizzati per studiare i cambiamenti morfologici in altre strutture cellulari o organismi modello al fine di definire la funzione genica e le conseguenze delle mutazioni associate alla malattia.
Iniziare preparando le diapositive per l'imaging. Posizionare una goccia di agarosio fuso su uno scivolo al microscopio e premere immediatamente lungo la goccia con un altro vetrino del microscopio, appiattindo delicatamente l'agarosio. Lasciare asciugare l'agarosio per un minuto, quindi separare accuratamente le due diapositive e lasciare il pad solidificato su una delle diapositive.
Posizionare lo scivolo sul palco del microscopio e aggiungere una goccia da cinque a 10 millilitri di anestetico al centro del tampone di agarosio. Utilizzare un piccone sterilizzato termicamente per trasferire rapidamente da 10 a 15 animali dalla piastra di scorta alla goccia anestetica prima che la soluzione si ascili. Quindi applicare una coverlip posizionandolo appena sopra il tampone di agarosio e facendolo cadere delicatamente verso il basso.
Immagini le regioni sinaptiche con un microscopio confocale a scansione di linea accoppiato a un laser a diodi semi-conduttore pompato otticamente da 488 e 552 nanometri e dotato di software di acquisizione delle immagini. Dopo aver individuato i worm, passare a un ingrandimento 40X e applicare un supporto di immersione. Visualizza la regione sinaptica eccitanti i fluorofori con un laser da 552 nanometri, l'1% di potenza per il fluoroforo tagRFP e 488 nanometri, il 2% di potenza per il fluorofore GFP.
Cattura immagini usando un fotodetetico ibrido e imposta i guadagni per evitare la sovraesposizione dei fluorofori. Raccogli le immagini dello stack Z per coprire l'intera sinapsi usando la dimensione ottimale del passo Z a seconda dell'obiettivo. Per analizzare l'area sinaptica iniziare caricando le immagini nel software CellProfiler 3.1.5.
Impostare il modulo NameAndType e determinare l'area sinaptica per definizione a mano utilizzando il tagRFP diffuso espresso dal transgene UIS-115. Misurare le dimensioni e la fluorescenza della sinapsi definita a mano aggiungendo i moduli MeasureObjectSizeShape e MeasureObjectIntensity alla pipeline. Quindi calcolare l'intensità di fluorescenza integrata relativa aggiungendo il modulo CalculateMath e dividendo le unità di intensità integrate ottenute da JSIS37 per quelle ottenute da UIS-115.
Al termine esportare tutte le misure e i calcoli. Per misurare l'area delle cellule muscolari aprire l'immagine nel software Fiji e utilizzare la selezione poligonale per tracciare attentamente intorno a una singola cellula muscolare obliqua. Regolare la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare la tracciatura.
Passare alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fare clic su Misura per calcolare l'area selezionata. Per le cellule muscolari con una regione degenerata o mancante tracciare l'area mancante con lo strumento di selezione poligonale e fare di nuovo clic su Misura. Se ci sono più spazi vuoti, traccia ognuno separatamente.
Calcolare il rapporto tra l'area dello spazio e l'area dell'intera cella. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare. E se non ci sono regioni mancanti, il rapporto viene calcolato come zero.
Apri elastico e scegli Classificazione pixel in Crea nuovo progetto. Rinominare e salvare il progetto. Passare alla scheda dati di input e fare clic su Aggiungi nuovo e quindi su Aggiungi immagini separate.
Indirizzare la finestra popup alla cartella con i file TIF e selezionare l'immagine desiderata. Nella scheda Selezione feature fare clic su Seleziona feature per selezionare tutte le feature pixel indicate dalle caselle verdi selezionate. La selezione di pixel in questo passaggio viene utilizzata per distinguere le diverse classi di pixel nel passaggio successivo.
Utilizzare un pannello Allenamento per distinguere tra i singoli filamenti di miosina che esprimono GFP e lo sfondo indesiderato. Fare clic su Aggiungi etichetta e scarabocchiare sfondi e spazi indesiderati tra i filamenti per iniziare l'allenamento del classificatore. Aggiungere una seconda etichetta, rinominarla in Filament e scarabocchiare su un certo numero di filamenti.
Clicca su Live Update per assicurarti che la classificazione sia stata eseguita correttamente. Se necessario, aggiungere altri scarabocchi per ottimizzare l'allenamento. Una volta eseguito il training classifier, passare al pannello Esportazione stima e fare clic su Scegli esporta impostazioni immagine con probabilità come origine.
Assicurarsi che le sottoregioni di ritaglio x e y siano spuntate e che c sia deselezionato. Selezionare zero e uno come valori di inizio e arresto per c e Converti tipo di dati in 8 bit non firmati. Selezionare Rinormalizza e quindi modificare il video del file di output in png, rinominando il file e la directory come desiderato.
Chiudere la finestra Impostazioni di esportazione ed esportare l'immagine appena segmentata. Quindi aprire il file png nel software Fiji. Regolate la soglia dell'immagine utilizzando le impostazioni predefinite e applicate il plug-in di skeletonization, che creerà una tabella separata dei risultati.
Questo protocollo è stato utilizzato per esplorare la funzione di alfa-tubulina acetiltransferasi MEC-17 nello sviluppo della sinapsi. L'analisi quantitativa delle immagini del microtubulo posteriore/laterale o delle sinapsi PLM indica che l'iperespressione di MEC-17 interrompe la normale funzione neuronale. Rispetto al tipo selvaggio, gli animali che sovraeprino il MEC-17 hanno ridotto significativamente le regioni presnaptiche e l'integrità sinaptica.
Queste tecniche sono state utilizzate anche per analizzare i modelli C.elegans di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2 o CMT2 portando mutazioni nei geni associati alla CMT2. La valutazione visiva della morfologia muscolare della parete corporea ha rivelato un aumento da 2,5 a 3,5 volte dei difetti negli animali da laboratorio rispetto al controllo del tipo selvaggio. Gli animali con mutazioni in fzo-1 e unc-116 hanno sperimentato perdita di striature muscolari, accumulo di detriti cellulari e degenerazione delle fibre muscolari.
Mentre gli animali con mutazioni nel dyn-1 hanno sperimentato significativamente meno difetti nella morfologia muscolare. I mutanti fzo-1 e unc-116 mostravano un aumento da cinque a sei volte del rapporto tra spazio e area totale a singola cellula e una lunghezza media delle fibre drammaticamente più breve rispetto agli animali di tipo selvatico. Per i confronti tra campioni è importante determinare le condizioni più ottimali per l'acquisizione di immagini e garantire che queste condizioni vengano utilizzate in modo coerente.
Queste tecniche permetteranno ai ricercatori di confrontare i cambiamenti morfologici su diversi background genetici con approcci quantitativi. Ciò riduce la soggettività e quindi contribuisce a migliorare la rappresentatività dei dati generati.
