A capacidade de quantificar mudanças na morfologia de tecidos e organelas é importante para entender a função genética, bem como o impacto das mutações genéticas. Nossos protocolos explicam como software livremente disponível pode ser usado para avaliar subjetivamente a morfologia de sinapses, músculos e mitocôndrias em um nematode, C.elegans. Muitos estudos anteriores se basearam em métodos qualitativos para comparar alterações morfológicas.
No entanto, estes podem ser problemáticos, pois podem não capturar diferenças fenotípicas sutis, podem superar e subestimar mudanças, e são avaliados subjetivamente. Nossos métodos quantitativos fornecem meios mais robustos e menos tendenciosos para avaliar mudanças morfológicas. Esses métodos poderiam ser facilmente utilizados para estudar alterações morfológicas em outras estruturas celulares ou organismos modelo, a fim de definir a função genética e as consequências das mutações associadas à doença.
Comece preparando slides para imagens. Coloque uma gota de uma ágarose derretida em um slide de microscópio e pressione imediatamente para baixo a gota com outro slide de microscópio, achatando suavemente a agarose. Deixe a agarose secar por um minuto e, em seguida, separe cuidadosamente os dois slides e deixe a almofada solidificada em um dos slides.
Coloque o slide no estágio do microscópio e adicione uma gota de 5 a 10 mililitros de anestésico ao centro da almofada de agarose. Use uma picareta esterilizada a calor para transferir rapidamente 10 a 15 animais da placa de estoque para a gota anestésico antes que a solução seque. Em seguida, aplique uma mancha de cobertura posicionando-a logo acima da almofada de agarose e gentilmente deixando-a cair.
Imagem as regiões sinápticas com um microscópio confocal de varredura de linha acoplado a um laser de diodo semicondutor de 488 e 552 nanômetros com bombeamento óptico e equipado com software de captura de imagem. Depois de localizar os worms, mude para uma ampliação de 40X e aplique meio de imersão. Visualize a região sináptica excitando os fluoroforos com um laser de 552 nanômetros, 1%de potência para o fluorophore tagRFP, e 488 nanômetros, 2% de potência para o fluoróforo GFP.
Capture imagens usando um fotodetetor híbrido e defina os ganhos para evitar a superexposição dos fluoroforos. Colete imagens de pilha Z para cobrir toda a sinapse usando o tamanho ideal da etapa Z, dependendo do objetivo. Para analisar a região sináptica comece carregando as imagens no software CellProfiler 3.1.5.
Configure o módulo NameAndType e determine a região sináptica por definição manual usando o tagRFP difuso expresso do transgene UIS-115. Meça o tamanho e a fluorescência da sinapse definida à mão adicionando os módulos MeasureObjectSizeShape e MeasureObjectIntensity ao pipeline. Em seguida, calcule a intensidade relativa da fluorescência integrada adicionando o módulo CalculandoMath e dividindo as unidades de intensidade integrada obtidas a partir de JSIS37 por aquelas obtidas do UIS-115.
Quando terminar a exportação de todas as medidas e cálculos. Para medir a área da célula muscular abra a imagem no software fiji e use a seleção de polígonos para rastrear cuidadosamente em torno de uma única célula muscular oblíqua. Ajuste a linha do polígono no final arrastando o ponto de âncora para melhorar o rastreamento.
Navegue até a guia Analisar na parte superior do software e clique em Medir para calcular a área selecionada. Para células musculares com região degenerada ou ausente, rastreie a área ausente com a ferramenta de seleção do polígono e clique em Medir novamente. Se houver múltiplas lacunas, rastreie cada uma separadamente.
Calcule a razão da área de lacuna para a área de toda a célula. Uma alta proporção indica maior extensão da degeneração muscular. E se não houver regiões ausentes, a razão é calculada como zero.
Abra o Elastic e escolha classificação de pixels em criar novo projeto. Em seguida, renomeie e salve o projeto. Navegue até a guia de dados de entrada e clique em Adicionar novo e, em seguida, Adicione imagens separadas.
Direcione a janela pop-up para a pasta com os arquivos TIF e selecione a imagem desejada. Na guia Seleção de recursos clique em Selecionar Recursos para selecionar todos os recursos de pixel indicados pelas caixas verdes marcadas. A seleção de pixels nesta etapa é usada para distinguir as diferentes classes de pixels na próxima etapa.
Use um painel de treinamento para distinguir entre os filamentos de minosina expressos por GFP individuais e o fundo indesejado. Clique em Adicionar rótulo e rabisque fundos e espaços indesejados entre os filamentos para iniciar o treinamento de classificadores. Adicione um segundo rótulo, renomeie-o para Filamento, e rabisque sobre uma série de filamentos.
Clique em Live Update para ter certeza de que a classificação foi feita corretamente. Se necessário, adicione mais rabiscos para afinar o treinamento. Uma vez realizado o classificador de treinamento, vá para o painel De exportação de previsão e clique em Escolher Configurações de imagem de exportação com probabilidades como a fonte.
Certifique-se de que as sub-regiões de recorte x e y estão marcadas, e c está sem marcação. Selecione zero e um como valores de inicial e parada para c e converta o tipo de dados para 8 bits não assinados. Marque Renormalizar e, em seguida, altere o vídeo do arquivo de saída para png, renomeando o arquivo e o diretório conforme desejado.
Feche a janela de configurações de exportação e exporte a imagem que acaba de ser segmentada. Em seguida, abra o arquivo png no software Fiji. Ajuste o limiar da imagem usando configurações padrão e aplique o plug-in de esqueletização, que criará uma tabela separada de resultados.
Este protocolo tem sido usado para explorar a função de acetiltransferase alfa-tubulin MEC-17 no desenvolvimento da sinapse. A análise quantitativa das imagens das sinapses posterior/lateral de microtúbulos ou PLM indica que a superexpressão do MEC-17 interrompe a função normal do neurônio. Em comparação com os animais de controle do tipo selvagem que expressam o MEC-17 reduziram significativamente as regiões pré-sinápticas e a integridade sináptica.
Essas técnicas também têm sido usadas para analisar modelos C.elegans de Charcot-Marie-Tooth tipo 2 ou CMT2 carregando mutações em genes associados ao CMT2. A avaliação visual da morfologia muscular da parede corporal revelou um aumento de 2,5 a 3,5 vezes nos defeitos nos animais de teste em comparação com o controle do tipo selvagem. Animais com mutações no fzo-1 e unc-116 experimentaram perda de estrias musculares, acúmulo de detritos celulares e degeneração de fibras musculares.
Enquanto animais com mutações no dyn-1 experimentaram significativamente menos defeitos na morfologia muscular. Os mutantes fzo-1 e unc-116 apresentaram um aumento de cinco a seis vezes na proporção de gap para área celular única total e um comprimento médio de fibra dramaticamente menor em comparação com animais do tipo selvagem. Para que sejam feitas comparações entre as amostras é importante determinar as condições mais ideais para a aquisição de imagens e garantir que essas condições sejam usadas de forma consistente.
Essas técnicas permitirão aos pesquisadores comparar alterações morfológicas em diferentes origens genéticas com abordagens quantitativas. Isso reduz a subjetividade e, portanto, ajuda a melhorar a representatividade dos dados gerados.
