Die Fähigkeit, Veränderungen in der Morphologie von Geweben und Organellen zu quantifizieren, ist wichtig für das Verständnis der Genfunktion sowie der Auswirkungen genetischer Mutationen. Unsere Protokolle erklären, wie frei verfügbare Software zur nicht-subjektiven Bewertung der Morphologie von Synapsen, Muskeln und Mitochondrien in einem Nematoden, C.elegans, verwendet werden kann. Viele frühere Studien stützten sich auf qualitative Methoden zum Vergleich morphologischer Veränderungen.
Diese können jedoch problematisch sein, da sie möglicherweise keine subtilen phätotypischen Unterschiede erfassen, Veränderungen über- und unterschätzen und subjektiv bewertet werden. Unsere quantitativen Methoden bieten robustere und weniger voreingenommene Mittel zur Bewertung morphologischer Veränderungen. Diese Methoden könnten leicht zur Untersuchung morphologischer Veränderungen in anderen zellulären Strukturen oder Modellorganismen verwendet werden, um die Genfunktion und die Folgen krankheitsassoziierter Mutationen zu definieren.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Dias für die Bildgebung. Legen Sie einen Tropfen eine geschmolzene Agarose auf ein Mikroskopschlitten und drücken Sie sofort mit einem anderen Mikroskopschlitten nach unten, wobei die Agarose sanft abgeflacht wird. Lassen Sie die Agarose für eine Minute trocknen, trennen Sie dann vorsichtig die beiden Rutschen und lassen Sie das erstarrte Pad auf einer der Dias.
Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und fügen Sie einen Fünf- bis 10-Milliliter-Tropfen Anästhetikum in die Mitte des Agarose-Pads. Verwenden Sie eine wärmesterilisierte Kommissionierung, um 10 bis 15 Tiere schnell von der Stockplatte auf das Anästhetikum zu übertragen, bevor die Lösung austrocknet. Dann einen Coverslip auftragen, indem Sie ihn direkt über dem Agarose-Pad positionieren und sanft fallen lassen.
Stellen Sie die synaptischen Regionen mit einem Zeilenscannen-Konfokalmikroskop in Verbindung mit einem optisch gepumpten Halbleiterdiodenlaser von 488 und 552 Nanometern und ist mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet. Nach dem Auffinden der Würmer wechseln Sie zu einer 40-fachen Vergrößerung und wenden Sie das Tauchmedium an. Visual die synaptische Region durch spannende die Fluorophore mit einem 552 Nanometer Laser, 1%Leistung für das TagRFP Fluorophor, und 488 Nanometer, 2%Leistung für das GFP-Fluorophor.
Erfassen Sie Bilder mit einem hybriden Photodetektor und stellen Sie die Gewinne ein, um eine Überbelichtung der Fluorophore zu verhindern. Sammeln Sie Z-Stack-Bilder, um die gesamte Synapse mit der optimalen Z-Schritt-Größe abhängig vom Objektiv abzudecken. Um den synaptischen Bereich zu analysieren, laden Sie zunächst die Bilder in die CellProfiler 3.1.5-Software.
Richten Sie das NameAndType-Modul ein und bestimmen Sie den synaptischen Bereich per Handdefinition mithilfe des diffusen TagRFP, das aus dem UIS-115-Transgen ausgedrückt wird. Messen Sie die Größe und Fluoreszenz der handdefinierten Synapse, indem Sie der Pipeline die Module MeasureObjectSizeShape und MeasureObjectIntensity hinzufügen. Berechnen Sie dann die relative integrierte Fluoreszenzintensität, indem Sie das CalculateMath-Modul hinzufügen und die aus JSIS37 erhaltenen integrierten Intensitätseinheiten durch die aus UIS-115 erhaltenen Einheiten dividieren.
Wenn Sie fertig sind, exportieren Sie alle Messungen und Berechnungen. Um die Muskelzellfläche zu messen, öffnen Sie das Bild in der Fidschi-Software und verwenden Sie die Polygonauswahl, um eine einzelne schräge Muskelzelle sorgfältig zu verfolgen. Passen Sie die Linie des Polygons am Ende an, indem Sie den Ankerpunkt ziehen, um die Ablaufverfolgung zu verbessern.
Navigieren Sie zur Registerkarte Analysieren oben in der Software, und klicken Sie auf Messen, um den ausgewählten Bereich zu berechnen. Bei Muskelzellen mit einem degenerierten oder fehlenden Bereich verfolgen Sie den fehlenden Bereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug, und klicken Sie erneut auf Messen. Wenn mehrere Lücken vorhanden sind, verfolgen Sie jede einzelne.
Berechnen Sie das Verhältnis der Spaltfläche zur Fläche der gesamten Zelle. Ein hohes Verhältnis deutet auf ein höheres Ausmaß der Muskeldegeneration hin. Und wenn keine Regionen fehlen, wird das Verhältnis als Null berechnet.
Öffnen Sie Elastic, und wählen Sie Pixelklassifizierung unter Neues Projekt erstellen. Benennen Sie dann das Projekt um, und speichern Sie es. Navigieren Sie zur Registerkarte Eingabedaten, klicken Sie auf Neu hinzufügen, und fügen Sie dann separate Bilder hinzu.
Richten Sie das Popupfenster mit den TIF-Dateien in den Ordner und wählen Sie das gewünschte Bild aus. Klicken Sie auf der Registerkarte Feature-Auswahl auf Features auswählen, um alle Pixel-Features auszuwählen, die durch die grünen Kontrollkästchen angezeigt werden. Die Pixelauswahl in diesem Schritt wird verwendet, um die verschiedenen Pixelklassen im nächsten Schritt zu unterscheiden.
Verwenden Sie ein Trainingspanel, um zwischen den einzelnen GFP-exemitten Myosin-Filamenten und unerwünschtem Hintergrund zu unterscheiden. Klicken Sie auf Label hinzufügen und unerwünschte Hintergründe und Leerzeichen zwischen den Filamenten durchforsten, um mit dem Klassifikaltraining zu beginnen. Fügen Sie eine zweite Beschriftung hinzu, benennen Sie sie in Filament um, und kritzeln Sie über eine Reihe von Filamenten.
Klicken Sie auf Live Update, um sicherzustellen, dass die Klassifizierung korrekt durchgeführt wurde. Fügen Sie bei Bedarf weitere Crawls hinzu, um das Training zu optimieren. Sobald der Trainingsklassifler durchgeführt wurde, gehen Sie zum Bedienfeld Vorhersageexport und klicken Sie auf Bildeinstellungen exportieren mit Wahrscheinlichkeiten als Quelle auswählen.
Stellen Sie sicher, dass die Ausschnitt-Unterregionen x und y angekreuzt sind und c nicht angekreuzt ist. Wählen Sie Null und eins als Start- und Stoppwerte für c und Konvertieren des Datentyps in nicht signierte 8-Bit. Kreuzen Sie Neunormalisieren und ändern Sie dann das Ausgabedateivideo in png, indem Sie die Datei und das Verzeichnis nach Belieben umbenennen.
Schließen Sie das Fenster Einstellungen exportieren, und exportieren Sie das gerade segmentierte Bild. Öffnen Sie dann die Png-Datei in Fidschi-Software. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes mithilfe der Standardeinstellungen an, und wenden Sie das Skelettierungs-Plug-In an, das eine separate Ergebnistabelle erstellt.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Funktion der Alpha-Tubulin-Acetyltransferase MEC-17 in der Synapsenentwicklung zu erforschen. Die quantitative Analyse von Bildern der hinteren/lateralen Mikrotubuli oder PLM-Synapsen zeigt, dass die Überexpression von MEC-17 die normale Neuronenfunktion stört. Im Vergleich zur Wildtypkontrolle haben überexponisierte MeC-17 präsynaptische Regionen und synaptische Integrität deutlich reduziert.
Diese Techniken wurden auch verwendet, um C.elegans Modelle von Charcot-Marie-Tooth Typ 2 oder CMT2 zu analysieren, die Mutationen in CMT2-assoziierten Genen tragen. Die visuelle Beurteilung der Körperwandmuskelmorphologie ergab eine 2,5- bis 3,5-fache Zunahme der Defekte bei den Versuchstieren im Vergleich zur Wildtypkontrolle. Tiere mit Mutationen in fzo-1 und unc-116 erlebten Verlust von Muskelsttriationen, Ansammlung von Zellablagerungen, und Muskelfaserdegeneration.
Während Tiere mit Mutationen in Dyn-1 deutlich weniger Defekte in der Muskelmorphologie erlebten. Die Mutanten fzo-1 und unc-116 zeigten eine fünf- bis sechsfache Zunahme des Verhältnisses von Lücke zu Gesamtfläche für Einzelzellen und eine dramatisch kürzere durchschnittliche Faserlänge im Vergleich zu Wildtieren. Für Vergleiche zwischen Proben ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für die Bildaufnahme zu bestimmen und sicherzustellen, dass diese Bedingungen konsistent verwendet werden.
Diese Techniken werden es den Forschern ermöglichen, morphologische Veränderungen über verschiedene genetische Hintergründe hinweg mit quantitativen Ansätzen zu vergleichen. Dies reduziert die Subjektivität und hilft somit, die Repräsentativität der generierten Daten zu verbessern.
