هذا البروتوكول هو مناسبة لإنتاج diterpenoids النقية التي يمكن استخدامها لتحليل المصب مختلفة ويمكن تخصيص لمجموعة من الأهداف الأيض مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو انها طريقة بسيطة وغير مكلفة لإنتاج كميات مليغرام من المستقلبات المتخصصة. من خلال تبادل الجينات والإنزيمات المستخدمة للتعبير المشترك ، يمكن تعديل هذه الطريقة لإنتاج تيربينويدات أخرى ، بما في ذلك monoterpenoids وsesquiterpenoids ، وكذلك فئات المستقلب الأخرى مثل الفلافونويدات.
لإنتاج الأيض diterpenoid والتحول، تبدأ من قبل ارتفاع درجة حرارة الخلايا القولونية المختصة كيميائيا على الجليد. عندما تذوب الثقافة، إضافة 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة لكل بناء إلى 1.5 ملليلتر المبردة microtube وإضافة 1 ميكرولتر من 100 نانوغرام في حل ميكرولتر كل بناء المستخدمة للتعبير المشترك. احتضان الخلائط على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط لطيف كل 10 دقائق عن طريق كشط الأنابيب عبر رف microtube.
في نهاية الحضانة، والحرارة صدمة خلائط الخلية في 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة قبل وضع الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين على الأقل. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية SOC المتوسطة إلى الأنابيب. واحتضان الثقافات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة.
في نهاية الحضانة، إضافة ما يقرب من 10 حبات الزجاج autoclaved و 100 ميكرولتر من الخلايا إلى واحد 37 درجة مئوية حرارة حساء lysogeny لوحة أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. وهز لوحة أفقيا مع الغطاء في مكان لتوزيع الخلايا بالتساوي. ثم، اضغط بلطف على الخرز الزجاجي في حاوية النفايات واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، سطح المغلفة الجانب إلى أسفل.
في اليوم التالي، قم بإزالة الطبق من الحاضنة. إضافة 5 ملليلتر من مرق lysogeny إعدادها حديثا المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة إلى واحد 15 ملليلتر أنبوب زجاجي معقمة مع غطاء بلاستيكية تنفس لكل ثقافة 1 لتر المخطط لها، واستخدام تلميح الأنابيب لاختيار الفردية المتحولة E.Coli المستعمرات من لوحة أجار. إضافة مستعمرة واحدة التقطت إلى كل من إعداد 15 ملليلتر أنابيب وقبعة كل أنبوب مع غطاء البلاستيك تنفس المصاحبة.
ثم ضع الثقافات الصغيرة الإشريكية القولونية المغطاة في حاضنة تهتز 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي إضافة 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 10x إلى 900 ملليلتر من مرق رائع في قارورة 1 لتر لكل ثقافة صغيرة مع المضادات الحيوية المناسبة. ووضع القارورة في 37 درجة مئوية و 140 دوران في الدقيقة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
عندما يكون مرق رائع دافئ, إضافة كامل 5 ملليلتر حجم كل ثقافة التطعيم إلى 1 لتر قارورة ثقافة لكل ثقافة. ووضع القارورة في حاضنة اهتزاز في تناوب 140 في الدقيقة لمدة 3 ساعات تقريبا. عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر 0.6، وخفض درجة حرارة الحاضنة إلى 16 درجة مئوية.
مرة واحدة وقد تبريد الحاضنة, إضافة 1 ملليلتر من IPTG مول واحد, 1 ملليلتر من إعداد طازجة 4 غرام لكل لتر الريبوفلافين و 1 ملليلتر من الطازجة 150 أعدت غراما لكل لتر aminolevulinic حمض لكل ثقافة. لإنتاج diterpenoid، إضافة 25 ملليلتر من بيروفات الصوديوم الضرس واحد إلى كل ثقافة لضمان تكوين السلائف كافية. ثم، احتضان الثقافات في 16 درجة مئوية و 140 التناوب في الدقيقة لمدة 72 ساعة، مضيفا 25 ملليلتر من بيروفات الصوديوم يوميا إلى الثقافات المناسبة.
لفصل المستقلب وتنقيته، قم بتأمين قمع فاصل على حامل حلقة في غطاء أبخرة. ووضع حاوية النفايات تحت القمع. صب 500 ملليلتر من محلول 50/50 من خلات الإيثيل وسداسيات في القمع الفاصل.
وإضافة 500 ملليلتر من تحويل E.coli ثقافة التعبير المشترك من الاهتمام في القمع. ضع سدادة الزجاج على القمع وهز القمع 5 إلى 10 مرات لخلط الثقافة مع المذيبات استخراج، وفتح في كثير من الأحيان حنفية في حين القمع هو رأسا على عقب ونقطة في غطاء محرك الدخان إلى degas القمع. بعد جولة ثانية من الهز وفك الغاز كما أظهرت للتو، وضع القمع تستقيم في موقف الحلبة لمدة دقيقة واحدة تقريبا.
عندما تنفصل طبقة المذيبات العلوية عن طبقة الثقافة مائي، إزالة سدادة واستنزاف طبقة القولونية في كوب النفايات، مع الاحتفاظ طبقة المذيبات داخل القمع. ثم، كرر الاستخراج مع 500 ملليلتر المتبقية من الثقافة باستخدام نفس 500 ملليلتر من المذيبات المستخدمة لاستخراج الأول، قبل استنزاف المذيبات التي تحتوي على المستقلبات المستخرجة في قارورة نظيفة. هنا، لدينا ممثل الكروماتوغرافيا الغاز-الطيف الكتل الكروماتوغرام من منتجات الإنزيم المستخرجة نموذجية هو مبين.
وتشمل المنتجات الثانوية الثانوية التي لوحظت عادة الكلورافينيكول ومشتقات الإندول أوكسيدوندول والإندول بيفالالدهيد. بعد تنقية الديتربينويد عن طريق الكروماتوغرافيا عمود السيليكا، يمكن الحصول على ثلاثة مركبات دولابراليكسين، كما كميا استنادا إلى منحنى قياسي باستخدام sclareol diterpenoid. الكروماتوغرافيا السيليكا مثالية لتحقيق نقاء عالية من المركبات المستهدفة.
لأنه يتيح إعداد بسيط من أوليفينات الديتربين والمشتقات المؤكسج وإزالة بسهولة اوكسيندل الملوثة الرئيسية، التي يتم الاحتفاظ بها على مصفوفة السيليكا. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام التعبير المشترك لجينات مسار التربينويد لإنتاج ديتربينويد في N.Benthamiana ، مما يؤدي إلى إنتاج دولارادين و 15 ، 16 إيبوكسيدولابرين. ينبغي أن تكون الأمثل المذيبات المستخدمة أثناء الاستخراج للخصائص الكيميائية الفيزيائية من المستقلبات ذات الفائدة ويجب أن لا تكون قابلة للخلط مع الماء للحفاظ على طبقتين متميزتين.
بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام المستقلبات النقية لتحليل المصب، بما في ذلك التحليل الهيكلي وأحماض المضادات الحيوية. وقد مكّنت هذه التقنية اكتشاف الـ diterpenoids الجديدة، بما في ذلك تلك المعروضة هنا، مما سمح بتحليل هذه الأيضات من أجل تركيبها الكيميائي وثنائية الأنشطة الجديدة. اتخاذ الاحتياطات عند استخدام المذيبات العضوية في مسار فصلي.
تأكد دائمًا من التخلص من النفايات البيولوجية وفقًا لمعايير السلامة في المختبر.
