Bu protokol, farklı downstream analizi için kullanılabilecek saflaştırılmış diterpenoidler üretmek için uygundur ve farklı metabolit hedefleri bir dizi için özelleştirilebilir. Bu yöntemin ana avantajı özel metabolitleri miligram miktarlarda üretmek için basit ve ucuz bir yöntemdir. Co-ekspresyon için kullanılan gen ler ve enzimler değiş tokuş ederek, bu yöntem monoterpenoidler ve sesquiterpenoidler de dahil olmak üzere diğer terpenoidler üretmek için değiştirilebilir, flavonoidler gibi diğer metabolit sınıfları.
Diterpenoid metabolik üretim ve dönüşüm için, kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerinin buz üzerinde ısınma ile başlar. Kültür çözüldüğünde, soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikrotüp için yapı başına 25 mikrolitre yetkin hücre ekleyin ve birlikte ifade için kullanılan her yapının mikrolitre çözeltisi başına 100 nanogram 1mikrolitre ekleyin. Bir mikrotüp raf boyunca tüpler kazıyarak nazik karıştırma ile 30 dakika buz üzerinde karışımları kuluçka.
Kuluçka sonunda, ısı en az iki dakika daha buz geri yerleştirerek önce bir dakika için 42 santigrat derece hücre karışımları şok. Daha sonra, tüplere 37 santigrat derece SOC orta 200 mikrolitre ekleyin. Ve kültürleri 37 derece ve dakikada 200 dönüşle bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, yaklaşık 10 otoklaved cam boncuk ve 100 mikrolitre hücre ekleyin bir 37 santigrat derece uygun antibiyotikler ile lysogeny suyu agar plaka ısıtılır. Ve hücreleri eşit dağıtmak için yerine kapak ile yatay olarak plaka sallayın. Daha sonra, yavaşça bir atık konteyner içine cam boncuk dokunun ve bir gecede 37 derece santigrat plaka kuluçka, kaplamalı yüzey tarafı aşağı.
Ertesi gün, tabağı kuvözden çıkarın. Planlanan 1 litrelik kültür başına plastik bir nefes kap ile bir 15 mililitre steril cam tüp uygun antibiyotikler ile taze hazırlanmış lysogeny suyu orta 5 mililitre ekleyin ve agar plaka bireysel dönüştürülmüş E.Coli kolonileri almak için bir pipet ucu kullanın. Hazırlanan 15 mililitrelik tüplerin her birine bir koloni ekleyin ve her tüpü eşlik eden nefes alabilen plastik kapakla kaplayın.
Sonra, 12 ila 24 saat boyunca kuvöz sallayarak 37 derece santigrat kapaklı E.coli küçük kültürler yerleştirin. Ertesi gün uygun antibiyotikler ile küçük kültür başına 1 litrelik şişe de müthiş suyu 900 mililitre 10x PBS 100 mililitre ekleyin. Ve şişeleri 37 santigrat derecede ve dakikada 140 dönüşte yaklaşık 30 dakika yerleştirin.
Müthiş suyu sıcak olduğunda, kültür başına bir 1 litrelik kültür şişesi için her aşılama kültürünün tüm 5 mililitre hacmi ekleyin. Ve yaklaşık 3 saat boyunca dakikada 140 rotasyonlar sallayarak inkübatör de şişeleri yerleştirin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6'ya ulaştığında, kuvöz sıcaklığını 16 dereceye düşürün.
Kuvöz soğuduktan sonra, her kültüre 1 mililitre azı iptg, 1 mililitre taze hazırlanmış 4 litre riboflavin ve 1 mililitre taze hazırlanmış 150 gram litre aminolevulinik asit ekleyin. Diterpenoid üretimi için, yeterli bir öncül oluşumunu sağlamak için her kültüre bir azı dişi sodyum pirüuvat 25 mililitre ekleyin. Daha sonra kültürleri 72 saat boyunca dakikada 16 derece ve 140 dönüşle kuluçkaya yatırın ve uygun kültürlere günlük 25 mililitre sodyum pirüvat ekler.
Metabolit ayırma ve arınma için, duman kaputundaki bir halka standına ayırıcı bir huniyi sabitlayın. Ve huninin altına bir atık kabı yerleştirin. 500 mililitre etil asetat ve heksanların 50/50 çözeltisini ayırın.
Ve dönüştürülmüş E.coli ortak ifade kültürünü huniye 500 mililitre ekleyin. Cam durdurucuyu huniye yerleştirin ve huniyi çıkarma çözücüsüyle karıştırmak için huniyi 5 ila 10 kez sallayın, huni baş aşağı yken sık sık musluğu açarak ve huniyi gazdan arındırmak için duman kaputuna doğru çevirin. Sallayarak ve gaz giderme ikinci bir tur sonra sadece gösterildiği gibi, yaklaşık bir dakika boyunca halka standında huni dik yerleştirin.
Üst çözücü tabakası sulu kültür tabakasından ayrıldığında, durdurucu çıkarın ve e.coli tabakasını bir atık kabına boşaltın, huni içindeki çözücü tabakasını koruyun. Daha sonra, ayıklanmış metabolitleri içeren çözücünün temiz bir şişeye boşaltılmadan önce, ilk ekstraksiyon için kullanılan aynı 500 mililitre çözücükullanılarak kültürün kalan 500 mililitresini kullanarak ekstraksiyonu tekrarlayın. Burada tipik çıkarılan enzim ürünlerinin temsili gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kromatrometrisi kromatografisi gösterilmiştir.
Yaygın olarak gözlenen küçük yan ürünler kloramfenikol ve indole türevleri oksindole ve indole pivalaldehit içerir. Silika kolon kromatografisi ile diterpenoid saflaştırma sonra, üç dolabralexin bileşikleri elde edilebilir, diterpenoid sclareol kullanarak standart bir eğri dayalı olarak ölçülür. Silika kromatografisi hedef bileşiklerin yüksek saflıkta elde etmek için idealdir.
Diterpen etekfinlerin ve oksijenli türevlerin basit hazırlanmasını sağladığından ve silika matrisinde tutulan büyük kontamine öküzdole'u kolayca ortadan kaldırır. Ayrıca, terpenoid yol genlerinin co-ekspresyonu N.Benthamiana diterpenoids üretmek için kullanılabilir, dolabradiene üretimi ile sonuçlanan ve 15, 16 epoksidolabrene. Ekstraksiyon sırasında kullanılan çözücüler, ilgi çeken metabolitlerin fiziksel kimyasal özellikleri için optimize edilmeli ve iki farklı katmanı korumak için su ile karıştırılmamalıdır.
Bu prosedürü takiben, saflaştırılmış metabolitler, yapısal analiz ve antibiyotik asitler de dahil olmak üzere downstream analizi için kullanılabilir. Bu teknik, burada gösterilenler de dahil olmak üzere yeni diterpenoidlerin keşfini sağlayarak bu metabolitlerin kimyasal yapıları ve yeni biactivies için analiz edilmesine olanak sağladı. Ayırıcı bir hunide organik çözücüler kullanırken önlem alın.
Biyolojik atıkları her zaman laboratuvar güvenlik standartlarınıza göre bertaraf edin.
