이 프로토콜은 다른 다운스트림 분석에 사용할 수 있으며 다양한 대사 산물 표적에 맞게 사용자 정의 할 수있는 정제 된 디테페노이드를 생산하는 데 적합합니다. 이 방법의 주요 장점은 전문 대사 산물의 밀리그램 양을 생산하는 간단하고 저렴한 방법입니다. 공동 발현에 사용되는 유전자와 효소를 교환함으로써, 이 방법은 모노테르페노이드 및 세스테커페노이드뿐만 아니라 플라보노이드와 같은 다른 대사산물 클래스를 포함한 다른 테르페노이드를 생산하도록 변형될 수 있다.
디테페노이드 대사 생산 및 변환을 위해, 얼음에 화학적으로 유능한 대장균 세포를 온난화로 시작합니다. 배양이 해동되면, 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 25마이크로리터의 유능한 세포를 추가하고 공동 발현에 사용되는 각 구조의 마이크로리터 용액당 100 나노그램의 마이크로리터를 추가한다. 마이크로튜브 랙을 가로질러 튜브를 긁어내고 10분마다 부드럽게 혼합하여 얼음에 혼합물을 30분 간 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 세포 혼합물을 섭씨 42도에서 1분 동안 충격한 후 세포를 얼음에 다시 2분 이상 다시 놓습니다. 다음으로, 튜브에 섭씨 37도 SOC 배지의 200 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 1시간 동안 섭씨 37도, 분당 200회 회전으로 문화를 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 약 10개의 오토클레이브 유리 구슬과 100마이크로리터의 세포가 37도에 적절한 항생제로 따뜻한 리조제니 국물 식도 판을 첨가한다. 그리고 뚜껑을 제자리에 놓고 접시를 수평으로 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. 그런 다음 유리 구슬을 폐기물 용기에 부드럽게 두드리고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 표면 측면을 아래로 코팅합니다.
다음 날 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 계획된 1리터 배양당 플라스틱 통기성 캡이 있는 15밀리리터 멸균 유리 튜브에 적절한 항생제를 장착한 갓 준비된 리소제니 국물 배지 5밀리리터를 추가하고, 파이펫 팁을 사용하여 한천 플레이트에서 개별 변형된 대장균을 선택합니다. 준비된 15밀리리터 튜브에 수확한 콜로니 1개를 추가하고 각 튜브에 통기성 이 가능한 플라스틱 캡을 장착합니다.
그런 다음, 12~24시간 동안 37도의 섭씨에 캡된 대장균 의 작은 문화를 배치합니다. 다음 날 100 밀리리터100 밀리리터를 900 밀리리터에 적절한 항생제로 작은 배양당 1리터 플라스크에 넣습니다. 그리고 플라스크를 섭씨 37도, 분당 140회전으로 약 30분간 놓습니다.
훌륭한 국물은 따뜻할 때 각 접종 문화의 전체 5 밀리리터 양을 문화당 1리터 문화 플라스크에 추가합니다. 그리고 약 3 시간 동안 분당 140 회전에 흔들리는 인큐베이터에 플라스크를 배치합니다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달하면 인큐베이터의 온도를 섭씨 16도로 줄입니다.
인큐베이터가 냉각되면, 1개의 어금음 IPTG 1밀리리터, 리터 리보플라빈 당 4그램, 각 배양에 리터 아미노레프룰린산 당 150그램을 신선하게 준비한 밀리리터 1밀리리터를 첨가하십시오. 디테페노이드 생산을 위해, 충분한 전구체 형성을 보장하기 위해 각 배양에 1개의 어금음 나트륨 피루바테의 25 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 72시간 동안 섭씨 16도, 분당 140회 회전으로 배양하여 매일 25밀리리터의 플루루바테 나트륨을 적절한 문화에 추가합니다.
대사 산물 분리 및 정화를 위해 연기 후드의 링 스탠드에 분리 깔때기를 고정하십시오. 그리고 깔때기 아래에 폐기물 용기를 놓습니다. 에틸 아세테이트와 헥산 50/50 용액의 500 밀리리터를 세파라토리 깔때기에 붓습니다.
그리고 유입경로에 관심의 변형된 E.coli 공동 발현 문화의 500 밀리리터를 추가합니다. 깔때기에 유리 스토퍼를 놓고 유입기를 5~10회 흔들어 추출 용매와 문화를 혼합하고, 깔때기가 거꾸로 되어 있는 동안 자주 첨탑을 열고 퍼널을 가스 후드로 가리키며 깔때기를 탈착시합니다. 방금 시연된 대로 두 번째 흔들림과 탈가스를 한 후, 깔때기를 링 스탠드에 똑바로 세워 약 1분간 놓습니다.
상부 용매 층이 수성 배양층과 분리되면 스토퍼를 제거하고 E.coli 층을 폐기물 비커로 배출하여 깔때기 내에서 용매 층을 유지합니다. 이어서, 추출된 대사산물을 함유한 용매를 깨끗한 플라스크로 배출하기 전에, 제1 추출에 사용되는 용매의 동일한 500 밀리리터를 사용하여 배양의 나머지 500 밀리리터를 사용하여 추출을 반복한다. 여기서, 대표적인 가스 크로마토그래피-질량 분광법 크로마토그램의 대표적인 추출 효소 제품이 나타난다.
일반적으로 관찰되는 경미한 부산물은 클로람페니콜과 인돌 유도체 옥신돌 및 인돌 피발알데히드를 포함한다. 실리카 컬 크로마토그래피를 통한 디테페노이드 정제 후, 디테페노이드 스클레어롤을 사용하여 표준 곡선에 따라 정량화된 3개의 돌라브랄렉신 화합물을 얻을 수 있다. 실리카 크로마토그래피는 표적 화합물의 고순도를 달성하는 데 이상적입니다.
디테르펜 올레핀과 산소화된 유도체의 간단한 제조를 가능하게 하고 실리카 매트릭스에 유지되는 주요 오염 된 옥신돌을 쉽게 제거합니다. 또한, 테르페노이드 경로 유전자의 공동 발현은 N.벤타미안에서 디테페노이드를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 그 결과 돌라브라디엔과 15, 16 에폭시돌라브렌의 생산이 초래된다. 추출 중에 사용되는 용매는 관심있는 대사 산물의 물리적 화학적 특성에 최적화되어야하며 두 개의 뚜렷한 층을 유지하기 위해 물과 혼합할 수 없어야합니다.
이 절차에 따라 정제 된 대사 산물은 구조 분석 및 항생제 산을 포함한 다운 스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 새로운 diterpenoids의 발견을 가능하게 했습니다, 여기에 표시된 것을 포함하여, 이 대사 산물은 그들의 화학 구조 및 새로운 biactivies를 위해 분석될 수 있도록. 분리 깔때기에서 유기 용매를 사용할 때 예방 조치를 취하십시오.
항상 실험실 안전 기준에 따라 생물학적 폐기물을 폐기해야 합니다.
