Dieses Protokoll eignet sich zur Herstellung von gereinigten Diterpenoiden, die für verschiedene nachgelagerte Analysen verwendet werden können und für eine Reihe von verschiedenen Metabolitenzielen angepasst werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es eine einfache und kostengünstige Methode ist, Milligramm Mengen an spezialisierten Metaboliten zu produzieren. Durch den Austausch der Gene und Enzyme, die für die Co-Expression verwendet werden, kann diese Methode modifiziert werden, um andere Terpenoide zu produzieren, einschließlich Monoterpenoide und Sesquiterpenoide, sowie andere Metabolitenklassen wie Flavonoide.
Für diterpenoide metabolische Produktion und Transformation, beginnen sie mit der Erwärmung chemisch kompetenter E.coli-Zellen auf Eis. Wenn die Kultur aufgetaut ist, fügen Sie 25 Mikroliter kompetenter Zellen pro Konstrukt zu einem gekühlten 1,5 Milliliter Mikrorohr hinzu und fügen Sie 1 Mikroliter einer 100 Nanogramm pro Mikroliter Lösung jedes Konstrukts hinzu, das für die Koexpression verwendet wird. Inkubieren Sie die Mischungen auf Eis für 30 Minuten mit sanftem Mischen alle 10 Minuten durch Kratzen der Rohre über ein Mikrorohr-Rack.
Am Ende der Inkubation schockieren die Zellenmischungen eine Minute lang bei 42 Grad Celsius, bevor sie die Zellen noch mindestens zwei Minuten auf eisern. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter 37 Grad Celsius SOC Medium zu den Rohren hinzu. Und bebrüten die Kulturen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute.
Am Ende der Inkubation etwa 10 autoklavierte Glasperlen und 100 Mikroliter Zellen zu einem 37 Grad Celsius erwärmten Lysogeny-Brühe-Agar-Platte mit den entsprechenden Antibiotika hinzufügen. Und schütteln Sie die Platte horizontal mit dem Deckel an Ort und Stelle, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Dann tippen Sie die Glasperlen vorsichtig in einen Abfallbehälter und bebrüten die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, beschichtete Oberflächenseite nach unten.
Entfernen Sie am nächsten Tag die Platte aus dem Inkubator. Fügen Sie 5 Milliliter frisch zubereitetes Lysogeny-Brühemedium mit den entsprechenden Antibiotika zu einem 15 Milliliter sterilen Glasrohr mit einer atmungsplastischen Kunststoffkappe pro geplanter 1-Liter-Kultur hinzu und wählen Sie mit einer Pipettenspitze einzelne transformierte E.Coli-Kolonien aus der Agarplatte. Fügen Sie jedem der vorbereiteten 15-Milliliter-Rohre eine gepflückte Kolonie hinzu und verkappen jedes Rohr mit der begleitenden atmungsaktiven Kunststoffkappe.
Dann legen Sie die gekappten E.coli-Kleinkulturen 12 bis 24 Stunden lang in einen 37 Grad Celsius schüttelnden Brutkasten. Am nächsten Tag 100 Milliliter 10x PBS zu 900 Millilitern grandioser Brühe in einen 1-Liter-Kolben pro kleiner Kultur mit den entsprechenden Antibiotika geben. Und legen Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und 140 Umdrehungen pro Minute für etwa 30 Minuten.
Wenn die grandiose Brühe warm ist, fügen Sie das gesamte Volumen von 5 Millilitern jeder Impfkultur zu einem 1 Liter Kulturkolben pro Kultur hinzu. Und legen Sie die Kolben in den Schüttel-Inkubator bei 140 Umdrehungen pro Minute für ca. 3 Stunden. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur des Inkubators auf 16 Grad Celsius.
Sobald der Inkubator abgekühlt ist, fügen Sie 1 Milliliter eines Molaren IPTG, 1 Milliliter frisch zubereitete 4 Gramm pro Liter Riboflavin und 1 Milliliter frisch zubereitete 150 Gramm pro Liter Aminolevulinsäure in jede Kultur. Für die Diterpenoid-Produktion, fügen Sie 25 Milliliter eines Molaren-Natriumpyruvat zu jeder Kultur, um eine ausreichende Vorläuferbildung zu gewährleisten. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 16 Grad Celsius und 140 Umdrehungen pro Minute für 72 Stunden, hinzufügen 25 Milliliter Natriumpyruvat täglich zu den entsprechenden Kulturen.
Zur Metabolitentrennung und -reinigung einen Trenntrichter auf einem Ringständer in einer Dunstabzugshaube sichern. Und legen Sie einen Abfallbehälter unter den Trichter. 500 Milliliter einer 50/50-Lösung aus Ethylacetat und Hexan in den Trenntrichter gießen.
Und fügen Sie 500 Milliliter der transformierten E.coli-Co-Expression-Kultur von Interesse in den Trichter. Legen Sie den Glasstopfen auf den Trichter und schütteln Sie den Trichter 5 bis 10 Mal, um die Kultur mit dem Extraktionslösungsmittel zu mischen, wobei sie häufig den Zapfen öffnet, während der Trichter auf dem Kopf steht, und ihn in die Dunstabzugshaube zeigen, um den Trichter zu entgasen. Nach einer zweiten Runde des Schüttelns und Entgasens, wie gerade gezeigt, stellen Sie den Trichter für etwa eine Minute aufrecht in den Ringständer.
Wenn sich die obere Lösungsmittelschicht von der wässrigen Kulturschicht getrennt hat, entfernen Sie den Stopfen und entleeren Sie die E.coli-Schicht in ein Abfallbecher, wodurch die Lösungsmittelschicht im Trichter beibehalten wird. Wiederholen Sie dann die Extraktion mit den restlichen 500 Millilitern der Kultur mit den gleichen 500 Milliliterl Lösungsmittel, die für die erste Extraktion verwendet wurden, bevor Sie das Lösungsmittel, das die extrahierten Metaboliten enthält, in einen sauberen Kolben entleeren. Hier wird unser repräsentatives Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Chromatogramm typischer extrahierter Enzymprodukte gezeigt.
Häufig beobachtete kleinere Nebenprodukte sind Chloramphenicol und die Indole-Derivate Oxindole und Indole-Pivalaldehyd. Nach der Diterpenoid-Reinigung mittels Kieselsäuresäulenchromatographie können drei Dolabralexinverbindungen erhalten werden, wie auf Basis einer Standardkurve mit dem Diterpenoid Sclareol quantifiziert. Die Kieselsäurechromatographie ist ideal, um eine hohe Reinheit der Zielverbindungen zu erreichen.
Da es die einfache Herstellung von Diterpenolefinen und sauerstoffhaltigen Derivaten ermöglicht und leicht die hauptkontaminierte Oxindole entfernt, die auf der Kieselsäurematrix zurückgehalten wird. Weiterhin kann die Koexpression der Terpenoid-Signalweggene zur Herstellung von Diterpenoiden in N.Benthamiana verwendet werden, was zur Produktion von Dolabradien und 15, 16 Epoxydolabren führt. Die während der Extraktion verwendeten Lösungsmittel sollten für die physikalischen chemischen Eigenschaften der von Interesse sindden Metaboliten optimiert werden und dürfen nicht mit Wasser vermischt werden können, um zwei unterschiedliche Schichten zu erhalten.
Nach diesem Verfahren können gereinigte Metaboliten für nachgelagerte Analysen, einschließlich Strukturanalysen und Antibiotikasäuren, verwendet werden. Diese Technik ermöglichte die Entdeckung neuer Diterpenoide, einschließlich der hier gezeigten, so dass diese Metaboliten auf ihre chemische Struktur und neue Biaktivien analysiert werden konnten. Vorsichtsmaßnahmen bei der Verwendung organischer Lösungsmittel in einem Trenntrichter.
Achten Sie immer darauf, biologische Abfälle gemäß Ihren Laborsicherheitsstandards zu entsorgen.
