Este protocolo é adequado para produzir diterpenóides purificados que podem ser usados para diferentes análises a jusante e podem ser personalizados para uma gama de diferentes alvos metabólitos. A principal vantagem deste método é que é um método simples e barato para produzir quantidades miligramas de metabólitos especializados. Ao trocar os genes e enzimas usados para co-expressão, este método pode ser modificado para produzir outros terpenóides, incluindo monoterpenóides e sesquiterpenóides, bem como outras classes metabólicas, como flavonoides.
Para produção e transformação metabólicas diterpenóides, comece pelo aquecimento quimicamente competente células E.coli no gelo. Quando a cultura descongelar, adicione 25 microliters de células competentes por construção a um microtubo refrigerado de 1,5 mililitro e adicione 1 microlitra de uma solução de 100 nanogramas por microlitra de cada construção usada para co-expressão. Incubar as misturas no gelo por 30 minutos com uma mistura suave a cada 10 minutos raspando os tubos através de um rack de microtubo.
No final da incubação, o calor choca as misturas celulares a 42 graus celsius por um minuto antes de colocar as células de volta no gelo por pelo menos mais dois minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de 37 graus celsius soc médio aos tubos. E incubar as culturas por uma hora a 37 graus celsius e 200 rotações por minuto.
No final da incubação, adicione aproximadamente 10 contas de vidro autoclavadas e 100 microliters de células a um caldo de nhogogênio aquecido de 37 graus celsius com os antibióticos apropriados. E agite a placa horizontalmente com a tampa no lugar para distribuir uniformemente as células. Em seguida, bata suavemente as contas de vidro em um recipiente de lixo e incubar a placa a 37 graus celsius durante a noite, revestida de superfície para baixo.
No dia seguinte, retire a placa da incubadora. Adicione 5 mililitros de caldo de lysogeny recém-preparado com os antibióticos apropriados a um tubo de vidro estéril de 15 mililitros com uma tampa respirável de plástico por cultura planejada de 1 litro, e use uma ponta de pipeta para escolher colônias E.Coli transformadas individuais da placa de ágar. Adicione uma colônia escolhida a cada um dos tubos preparados de 15 mililitros e tampa cada tubo com a tampa de plástico respirável que acompanha.
Em seguida, coloque as pequenas culturas E.coli tampadas em uma incubadora de agitação de 37 graus celsius por 12 a 24 horas. No dia seguinte, adicione 100 mililitros de PBS de 10x a 900 mililitros de caldo fantástico em um frasco de 1 litro por pequena cultura com os antibióticos apropriados. E coloque os frascos a 37 graus celsius e 140 rotações por minuto por aproximadamente 30 minutos.
Quando o caldo fantástico estiver quente, adicione todo o volume de 5 mililitros de cada cultura de inoculação a um frasco de cultura de 1 litro por cultura. E coloque os frascos na incubadora a 140 rotações por minuto durante aproximadamente 3 horas. Quando a densidade óptica de 600 nanômetros atingir 0,6, reduza a temperatura da incubadora para 16 graus celsius.
Uma vez que a incubadora tenha esfriado, adicione 1 mililitro de um IPTG molar, 1 mililitro de 4 gramas por litro de riboflavina e 1 mililitro de ácido aminolevulinic recém-preparado para cada cultura. Para a produção de diterpenóides, adicione 25 mililitros de um piruvato de sódio molar a cada cultura para garantir uma formação precursora suficiente. Em seguida, incubar as culturas a 16 graus celsius e 140 rotações por minuto durante 72 horas, adicionando 25 mililitros de piruvato de sódio diariamente às culturas apropriadas.
Para separação metabólica e purificação, fixar um funil separador em um suporte de anel em um capô de fumaça. E coloque um recipiente de lixo sob o funil. Despeje 500 mililitros de uma solução 50/50 de acetato etílico e hexanos no funil separador.
E adicionar 500 mililitros da cultura de co-expressão transformada de E.coli no funil. Coloque a rolha de vidro no funil e agite o funil 5 a 10 vezes para misturar a cultura com o solvente de extração, abrindo frequentemente o espigão enquanto o funil está de cabeça para baixo e aponte-o para o capô da fumaça para desgas o funil. Depois de uma segunda rodada de agitação e desgaseamento como apenas demonstrado, coloque o funil ereto no suporte do anel por aproximadamente um minuto.
Quando a camada de solvente superior tiver se separado da camada de cultura aquosa, remova a rolha e escorra a camada E.coli em um béquer de resíduo, mantendo a camada de solvente dentro do funil. Em seguida, repita a extração com os 500 mililitros restantes da cultura usando os mesmos 500 mililitros de solvente usados para a primeira extração, antes de drenar o solvente contendo os metabólitos extraídos em um frasco limpo. Aqui, nosso cromatógrafo de espectrometria de massa gasosa representativo é mostrado.
Subprodutos menores comumente observados incluem clororamfenicol e os derivados indol oxindole e pivalaldeído indole. Após a purificação de diterpenóides através da cromatografia da coluna de sílica, três compostos de dolabralexina podem ser obtidos, conforme quantificado com base em uma curva padrão usando o diterpenoid sclareol. A cromatografia de sílica é ideal para alcançar uma alta pureza dos compostos alvo.
Uma vez que permite a simples preparação de olefinas diterpene e derivados oxigenados e prontamente remove o oxindole contaminado principal, que é retido na matriz de sílica. Além disso, a co-expressão dos genes da via terpenóide pode ser usada para produzir diterpenóides em N.Benthamiana, resultando na produção de dolabradiene e 15, 16 epóxidolabrene. Os solventes utilizados durante a extração devem ser otimizados para as propriedades químicas físicas dos metabólitos de interesse e não devem ser misturados com água para manter duas camadas distintas.
Após este procedimento, metabólitos purificados podem ser usados para análise a jusante, incluindo análise estrutural e ácidos antibióticos. Esta técnica permitiu a descoberta de novos diterpenóides, incluindo os aqui mostrados, permitindo que esses metabólitos fossem analisados para sua estrutura química e novas biativas. Tome precauções ao usar solventes orgânicos em um funil separador.
Certifique-se sempre de descartar resíduos biológicos de acordo com seus padrões de segurança de laboratório.
