ينطبق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من مشاريع الفحص التي تهدف إلى تطوير مثبطات ATPase ، إما كمسبارين للبحوث الأساسية أو للمركبات السريرية المحتملة. تم تحسين هذا الأسلوب لتطبيقات فحص نصف عالية الإنتاجية. كما تم تصميمه لتجنب العديد من القطع الأثرية الشائعة ولا يتطلب التعامل مع المواد الخطرة.
في مختبرنا كنا نستخدم هذا الفحص لتطوير مثبطات جديدة ومحددة غير العضلات الميوسين الثاني لعلاج اضطراب تعاطي الميثامفيتامين. من الناحية النظرية، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أي إنزيمات تنتج ATP. المرئية مظاهرة يساعد على توضيح جميع التفاصيل التقنية الهامة.
للبدء، وإعداد 4، 500 ميكرولترات من 20 محلول أكتين المخفف microin microstyrene 384-well الأسود عن طريق تمييع حل المخزون actin المركزة في المخزن المؤقت actin. خلط الحل بدقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 30 مرة لكسر خيوط actin للحد من اللزوجة وعدم التجانس. ثم الطرد المركزي الحل لإزالة أي البروتين المترسب الحاضر.
نقل بعناية فائقة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. إعداد مزيج انزيم رئيسي في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر لكل لوحة مُقايسة من خلال الجمع بين 3، 252.9 ميكرولترات من العازلة الميوسين للميوزين للمقايسة التي تنطوي على عضلة الهيكل العظمى myosin II، 171.4 ميكرولترات من حل LDH، و 171.4 ميكرولترات من محلول PK. إعداد مزيج الركيزة الرئيسية في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر لكل لوحة من خلال الجمع بين 162.1 ميكرولترات من ATP، 162.1 ميكرولترات من PEP، و 324.1 ميكرولترات من حل NADH.
لا تضيف actin في هذه المرحلة لتجنب التجميع وهطول الأمطار. لإنشاء سبع خطوات التسلسلي واحد إلى اثنين من التخفيفات من NADH للمعايرة، وإعداد ثمانية أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر. مزيج 12.3 ميكرولترات من محلول الأسهم NADH مع 257.7 ميكرولترات من العازلة myosin في الأنبوب الأول لجعل حل 250 micromolar.
ثم aliquot 135 ميكرولترات من العازلة myosin في كل من الأنابيب السبعة المتبقية. نقل 135 ميكرولترات من الحل من الأنبوب الأول إلى الثانية ومزيج عن طريق الأنابيب. كرر حتى تصل إلى أنبوب السابع.
استخدام أنبوب آخر كما لا-NADH السيطرة مع المخزن المؤقت فقط. وتشمل دائما الضوابط الإيجابية والسلبية على لوحات المركب، والتخفيفات NADH للمعايرة على لوحات المقايسة. عناصر التحكم هذه مهمة للغاية لتحديد النتائج أثناء تحليل البيانات.
باستخدام ماصة ذات ثماني قنوات، قم بنقل 20 ميكرولترات من حلول معايرة NADH إلى الصف الأول في ثلاث اطماعات في لوحة فحص. الآن إضافة 4.2 ميكرولترات من العضلات الهيكل العظمي myosin الثاني إلى مزيج انزيم. دوامة لفترة وجيزة.
إضافة myosin إلى مزيج انزيم الحق قبل الاستغناء. الحضانة الطويلة من المحاليد الميوسين المخفف قد يؤدي إلى فقدان النشاط بسبب هطول الأمطار، وغير محددة ملزمة للأسطح البلاستيكية. قم بتحميل مزيج انزيم الميوسين المعد في واحدة من حاويات العينة للموزع التلقائي.
في لوحة، باستثناء الصف الأول، الاستغناء 8.4 ميكرولترات من مزيج انزيم الميوسين في كل بئر من لوحة المقايسة. ثم ضع لوحة الفحص ولوحة المركب على مُواهيات المختبرات لنظام معالجة سائل آلي مجهز برأس أداة دبوس 100 نانولتر. ثم تشغيل الطريقة المناسبة في البرنامج لنقل 100 نانولترات من الحلول من لوحة مجمع المعدة إلى لوحة المقايسة.
بعد ذلك، ضع لوحة المقايسة على متن لوحة صغيرة لتهز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند 1، 200 دورة في الدقيقة. إضافة 4، 052 ميكرولترات من حل actin الطرد المركزي إلى مزيج الركيزة ودوامة لفترة وجيزة. لبدء التفاعل الأنزيمي، الاستغناء 11.6 ميكرولترات من مزيج الركيزة actin في كل بئر من لوحة المقايسة باستخدام موزع التلقائي، باستثناء الصف الأول.
على شاكر microplate، يهز لوحة المقايسة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في 1، 200 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي لوحة المقايسة في 101 مرات ز لمدة 30 ثانية. استخدام 380 نانومتر، 10 نانومتر عرض الفرقة مرشح، و 470 نانومتر، 24 نانومتر عرض الفرقة مرشح الانبعاثات بالتزامن مع 425 نانومتر قطع مرآة dichroic للمقايسات.
تحسين عدد من ومضات، مكاسب كاشف، أبعاد لوحة وارتفاع القياس قبل تشغيل المقايسات. تشغيل القياس في وضع التركيز العالي. تأكد من أن درجة الحرارة الداخلية لقارئ لوحة استقرت عند 25 درجة مئوية.
تحميل لوحة في قارئ لوحة ويهز لمدة 30 ثانية أخرى لجعل شكل السطح السائل مماثلة في كل بئر والسماح لوحة للوصول إلى درجة حرارة القياس. مسح لوحة في فترات 45 ثانية وسجل الفلورس NADH لمدة 30 دقيقة. مع البيانات المصدرة، رسم شدة الفلورس الملاحظة مع الزمن لكل بئر.
تنفيذ انحدار خطي بسيط لتحديد الميل واعتراض استجابات الفلوريسنس لكل بئر. الميل يتناسب مع معدل استهلاك NADH الذي يمكن استخدامه كتقريب جيد جداً لمعدل استهلاك ATP. التقاطع يتناسب مع تركيز NADH في بداية القياس.
ثم، بناء منحنى معايرة لDH عن طريق رسم اعتراض حصلت على الصف الأول من لوحة ضد تركيز NADH. تقدر عمليات الاعتراض شدة الفلورس الحقيقي في البداية بثقة أكبر بكثير من متوسط كثافة الفلورسنسي الخام التي تقرأ في البداية. تنفيذ انحدار خطي بسيط للحصول على الميل واعتراض خط معايرة NADH.
هنا، يصف الاعتراض إشارة خلفية الفلوريسنس مع عدم وجود NADH، في حين أن المنحدر يتوافق مع كثافة الفلورس النظرية استقراء من محلول NADH الضرس واحد. لتحويل التغيرات المفلورة إلى معدلات استهلاك ATP تقسيم المنحدر من الاستجابة fluorescence التي تم الحصول عليها لبقية الآبار من قبل المنحدر من خط معايرة NADH. بعد ذلك، رسم معدلات استهلاك ATP ضد تركيز المانع.
لتحديد الثوابت المثبطة، استخدم أي برنامج إحصائي مناسب قادر على تركيب المنحنى غير الخطي، مثل Origin 2017. حدد منحنى غير خطي مناسب لاحتواء بيانات استجابة الجرعة مع معادلة تربيعية تقابل نموذج توازن ملزم واحد لواحد بسيط. Y هو معدل استهلاك ATP.
Y-الحد الأدنى هو معدل استهلاك ATP في غياب المانع. Y-الحد الأقصى هو معدل استهلاك ATP النظري عند تثبيط 100٪. t و t هي التركيز الكلي للزيم والمثبطات الميوسين، على التوالي.
KI هو ثابت مثبطة. في هذه الدراسة, الهيكل العظمي والقلب عضلة myosin الثاني ATPase أظهرت ردود الفعل آثار كثافة الفلورانس الخطي بغض النظر عن myosin المستخدمة أو وجود مثبطات. أظهرت معدلات ATPase القاعدية و actin تنشيط الاعتماد الخطي على تركيز الهيكل العظمي أو عضلة القلب myosin II.A معامل نافذة الفحص أو عامل Z من 0.78 أشار إلى مقايسة موثوق بها مع ضوابط إيجابية وسلبية بشكل جيد جداً.
أظهر Blebbistatin، و para-Aminoblebbistatin، وشبه Nitroblebbistatin منحنيات استجابة الجرعة العادية عند أو أقل من قيم الذوبان المبلغ عنها. تم تحديد الثوابت المثبطة لكل من القلب والعضلات الهيكلية myosin IIs عن طريق تركيب معادلة تربيعية تمثل نموذجًا بسيطًا ملزمًا للتوازن للبيانات. أظهرت آثار كثافة الفلوريسنس لبليبيتاتين التي تم الحصول عليها في مقايسة ATPase باستخدام العضلات الهيكلية العضلية II إشارة انخفاض خطي طبيعي اعتمادًا على كمية المانع الموجودة.
ومع ذلك ، فوق ذوبان blebbistatin لوحظ زيادة غير متوقعة في الإشارة على الأرجح بسبب تشكيل بلورات blebbistatin الفلورسنت الزاهية. وفي حالة شبه Nitroblebbistatin ذات آثار شدة الفلورية الخام العادية، فإن معدلات التفاعل التي تم الحصول عليها فوق القابلية للذوبان قد انحرفت عن منحنى الاستجابة للجرعة المحددة بسبب هطول الأمطار. باستخدام هذه الطريقة، قمنا بتطوير مثبطات الميوسين الجديدة، القوية، والانتقائية التي يمكن استخدامها كأدوات علمية في البحوث الأساسية أو كمرشحين مباشرين في المستقبل.
من المستحسن دائماً استخدام ATPase مختلفة أو غيرها من الأقوال الفنية المحددة لأنزيم الفائدة للتمييز بين الضربات الإيجابية الحقيقية والزائفة. كل البروتينات تربط الأسطح البلاستيكية. هذه المشكلة يمكن أن تؤثر بشدة على النتائج، وخاصة إذا كان البروتين موجود في تركيزات منخفضة.
تجنب دائما معالجة السائل لا لزوم لها، واستخدام أنابيب غير ملزمة. تتطلب عادةً مقايسات ATPase البديلة مناولة حمض الكبريتيك أو المواد السامة أو المواد المشعة. وعلى النقيض من ذلك، تتطلب مقايسات ATPase المرتبطة بـ NADH كاشفات بدون سمية أو سمية منخفضة للغاية فقط.
