该协议适用于旨在开发 ATPase 抑制剂的广泛筛选项目，无论是作为基础研究的探针，还是作为潜在临床化合物的探针。此方法已针对半高通量筛选应用进行了优化。它还被设计为避免一些常见的伪影，它不需要处理危险材料。
在我们的实验室中，我们一直在使用这种检测来开发新的和特定的非肌肉肌素II抑制剂，用于治疗甲基安非他明使用障碍。从理论上讲，这种方法可以很容易地应用于任何产生ATP的酶。可视化演示有助于澄清所有重要的技术细节。
首先，通过稀释行动素缓冲液中的浓缩蛋白库存溶液，为每384孔黑色聚苯乙烯微孔板准备4，500微升20微摩尔稀释的蛋白溶液。通过上下移液 30 次彻底混合溶液，以打破行为素丝，降低粘度和异质性。然后离心溶液，去除任何沉淀的蛋白质。
小心地将上清液转移到干净的离心管中。将3，252.9微升肌素缓冲液组合到每个检测板的15毫升锥形离心管中，为涉及骨骼肌素II、171.4微升的LDH溶液和171.4微升的PK溶液进行测定，以准备主酶混合物。将 162.1 微升 ATP、162.1 微升 PEP 和 324.1 微升 NADH 溶液组合在 15 毫升锥形离心管中，为每个板准备主基板混合。
此时不要添加 actin 以避免聚合和沉淀。要创建七步串行一到两个 NADH 稀释校准，请准备 8 个 1.5 毫升微离心管。将 12.3 微升的 NADH 库存溶液与 257.7 微升的明辛缓冲液混合在第一管中，以制作 250 微摩尔溶液。
然后将135微升的米奥辛缓冲液放入剩余的7个管子中。将溶液的135微升从第一管转移到第二管中，然后通过移液混合。重复，直到到达第七管。
使用最后一根管子作为无 NADH 控制，仅带缓冲液。始终在复合板上包括正负控制，以及用于检测板上校准的 NADH 稀释。这些控件对于在数据分析期间识别工件非常重要。
使用八通道移液器，将 20 微升的 NADH 校准解决方案转移到检测板中三分的第一排。现在添加4.2微升的骨骼肌肌素II到酶混合物。漩涡简单。
在配药前将明西辛加入酶混合物中。稀释的明蛋白溶液的长期孵育可能导致因降水而丧失活性，并且与塑料表面有非特异性结合。将制备的明素酶混合物装入自动分配器的样品容器之一。
在板中，除第一排外，将8.4微升的明辛酶混合到检测板的每个井中。然后将检测板和复合板放在配备 100 纳米引脚工具头的自动液体处理系统的实验室设备定位器上。然后在软件中运行适当的方法，将100纳米的溶液从准备好的复合板转移到测定板。
接下来，将检测板放在微孔板摇床上，在 1，200 rpm 的室温下摇动一分钟。将离心剂溶液的4，052微升加入基板混合和涡流中。为了开始酶反应，使用自动分配器将11.6微升的物基板混合到检测板的每个井中，第一排除外。
在微孔板摇床上，在室温下以 1，200 rpm 摇动检测板一分钟。以101倍g离心检测板，30秒。使用 380 纳米、10 纳米带宽度激励滤波器和 470 纳米、24 纳米带宽度发射滤波器以及 425 纳米切断二色镜进行测定。
在运行检测之前，优化闪烁数量、检测器增益、板尺寸和测量高度。在高浓度模式下运行测量。确保板读卡器的内部温度稳定在 25 摄氏度。
将板装入板读卡器并摇动 30 秒，使每个井中的液体表面形状类似，并允许板达到测量温度。以 45 秒的间隔扫描板，并记录 NADH 荧光 30 分钟。使用导出的数据，绘制每个井的观测荧光强度与时间的关系。
执行简单的线性回归，以确定每一井的荧光响应的斜率和截距。斜率与 NADH 消耗率成正比，这可用作 ATP 消耗率的非常好的近似值。截距与测量开始时的 NADH 浓度成正比。
然后，根据 NADH 的浓度绘制板第一行获得的截距，为 NADH 构建校准曲线。截距估计真正的荧光强度在开始，比原始荧光强度读取在开始的平均值更有信心。执行简单的线性回归以获取 NADH 校准线的斜率和截距。
在这里，截距描述了没有 NADH 存在的荧光背景信号，而斜率对应于一个摩尔 NADH 溶液的外推理论荧光强度。要将荧光变化转换为 ATP 消耗率，请将 NADH 校准线的斜率除以其余孔的荧光响应的斜率。接下来，根据抑制剂的浓度绘制 ATP 消耗率。
要确定抑制常数，请使用任何能够非线性曲线拟合的适当统计软件，如 Origin 2017。选择非线性曲线拟合，使剂量-响应数据与对应于简单一对一结合均衡模型的二次方程保持一对一。Y 是 ATP 消耗率。
Y-最小值是无抑制剂的ATP消费率。Y-最大值是理论ATP消费率在100%抑制。t 和 t 分别是明蛋白酶和抑制剂的总浓度。
KI 是抑制常数。在这项研究中，骨骼和心肌肌素II ATPase反应显示线性荧光强度痕迹，无论使用的肌素或抑制剂的存在。基础和活性 ATPase 率显示线性依赖骨骼或心肌肌素 II 的浓度。筛查窗口系数或 Z 因子 0.78 表示可靠的检测，具有非常分离的阳性和负对。
布莱比斯塔汀、准氨基苯甲酸素和准硝基比斯塔汀在报告溶解度值或低于其报告的溶解度值时显示定期剂量反应曲线。心脏和骨骼肌的抑制常数通过拟合一个表示简单平衡结合模型的数据的二次方程来确定。使用骨骼肌素II在 ATPase 测定中获得的 blebbistatin 的荧光强度轨迹显示正常线性递减信号，具体取决于存在抑制剂的数量。
然而，在 blebistatin 的溶解性之上，观察到信号的意外增加很可能是由于形成明亮的荧光 blebistatin 晶体。在具有正常原荧光强度痕迹的准硝基硝基丁的情况下，由于降水，获得上述溶解度的反应速率与确定的剂量-反应曲线不同。通过使用这种方法，我们开发了新的，有效的，选择性的明蛋白抑制剂，可以用作科学研究的科学工具或作为未来的直接候选者。
始终建议使用特定于感兴趣的酶的其他 ATPase 或其他功能检测来区分真阳性和假阳性命中。所有蛋白质都结合塑料表面。此问题可以严重影响结果，特别是当蛋白质存在于低浓度。
始终避免不必要的液体处理，并使用非结合管。替代 ATPase 检测通常需要处理硫酸、有毒物质或放射性物质。相比之下，NADH相关 ATPase 检测仅需要无毒性或非常低毒性的试剂。
