وظيفة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية لتجديد الخلايا الجذعية ذاتية الدم. نشاط الميتوكوندريا هو انعكاس لإمكانية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، والذي يمكن قياسه بواسطة TMRM ، وهو صبغة فلورية الخلية ، صبغة صبغة ملونة بالخلايا. مضخات efflux xenobiotic نشطة للغاية في HSC، وتسبب TMRM البثق.
الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول، هو تصحيح هذا التأثير، وذلك باستخدام فيراباميل، وهو المانع لمضخات efflux. تبدأ من خلال عزل نخاع العظم من عظم الفخذ الماوس. استخدام زوج من ملقط ومقص حاد لقطع الكفوف الخلفية اثنين.
ثم جعل قصاصة صغيرة في الجلد البطني من الماوس، وتمتد عليه. استخراج عظم الفخذ والساق، مع الحرص على عدم طرد رؤساء عظم الفخذ، ووضع العظام في لوحة ستة بئر، مليئة 1.5 ملليلتر من العازلة تلطيخ. إزالة العضلات من العظام، وقطع نهايات العظام، والسماح للنخاع العظمي للخروج.
ضع العظام النظيفة في آبار جديدة، مع 1.5 ملليلتر من عازلة تلطيخ. ثم، طرد نخاع العظم مع حقنة ثلاثة ملليلتر وإبرة قياس 25، حتى يصبح العظم أبيض. جمع جميع الخلايا في أنبوب 1.5 ملليلتر، والطرد المركزي لهم لمدة خمس دقائق في 180 مرات G، ثم تجاهل نابيرانت.
بعناية resuspend بيليه في 300 ميكرولترات من الجليد الباردة ACK lysing العازلة، ووضع الخلايا على الجليد لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإلغاء تنشيط فوراً عن طريق إضافة ملليلتر واحد من مخزن البقع المؤقت. الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في 180 مرة G.Resuspend بيليه الخلية، والتي ينبغي أن تظهر بيضاء، في ملليلتر واحد من عازلة تلطيخ.
تصفية الخلايا باستخدام غطاء مصفاة الخلية، مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر، للحصول على خلايا أحادية النوى. ابدأ بإعداد كوكتيل النسب، والأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروهور، وفقًا لاتجاهات المخطوطات. إبقاء الأجسام المضادة على الجليد، ومحمية من الضوء.
ثم، الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في 180 مرات G، والتخلص من الفائق. إضافة 400 ميكرولتررس من كوكتيل النسب، وأربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة CD135 biotinylated إلى بيليه الخلية، ودوامة الخليط. ثم احتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة، وغسل العينة عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة تلطيخ، والغزل عليه لمدة خمس دقائق في 180 مرة G، والتخلص من supernatant. ثم إضافة 400 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة، ودوامة الخليط. احتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة أخرى ، وتكرار الغسيل مع عازلة تلطيخ.
لإعداد حل تلطيخ TMRM ، أضف 2.2 ميكرولترات من محلول الأسهم TMRM ، و 1.1 ميكرولترات من فيراباميل ، إلى 1.1 ملليلتر من الاستزراع الدموي الخالي من الدم ، مع عامل الجلطات والخلايا الجذعية. إعادة زرع نخاع العظم في ملليلتر واحد من TMRM تلطيخ الحل، دوامة بسرعة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. تصفية العينة باستخدام غطاء مصفاة الخلية، مع شبكة النايلون 35 ميكرومتر، لتجنب انسداد جهاز قياس التدفق.
ثم إضافة ميكرولتر واحد من DAPI والمضي قدما مع تدفق القياسات. تشغيل عينة نخاع العظام، والحصول على ما لا يقل عن مليون الأحداث. ثم عرض خلايا أحادية النواة نخاع العظم الحية في مؤامرة وزرقاء المحيط الهادئ، لتحديد الكسور السلبية لـ CD135 Lin و Lin-positive.
رسم الكسر Lin سالب لـ APC/Cy7 مقابل PE/Cy7 لتحديد الكسر السلف أو MPP متعدد القدرات. ثم رسم جزء MPP لـ APC مقابل PerCP/Cy5.5، لتحديد الخلايا الجذعية الدموية أو كسر HSC. عرض كسر HSC لـ FITC أو CD34، لتقسيمه إلى كسور HSC سالبة CD34 و CD34.
وأخيرا الحصول على كثافة TMRM في كل مجموعة من السكان. لضمان أن تلطيخ TMRM يعمل بشكل صحيح، إضافة ميكرولتر واحد من FCCP إلى العينة، لتركيز نهائي من ملليمتر واحد، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم الحصول على مليون حدث.
بعد إضافة FCCP، ينبغي زيادة كثافة TMRM بشكل كبير. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في مختلف مجموعات الخلايا، مع صبغة TMRM. وقد ثبت أن وجود PBS و FBS في الوسط الثقافة يؤثر على كثافة إشارة TMRM.
لذلك من المهم تنفيذ تلطيخ TMRM في وسيط التوسع الخالي من المصل. الخلايا الجذعية الدموية التعبير عن مستويات عالية من النشاط من مضخات efflux xenobiotic أن قذف TMRM صبغ. حتى TMRM أيضا تختلف في وجود فيراباميل أو Cyclosporin H، والتي تمنع المضخات.
للتحقق من دقة تلطيخ TMRM، يمكن أن يكون FCCP لإزالة قطب الميتوكوندريا، وتقليل كثافة TMRM. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لدراسة HSC مع صبغة غشاء ميتوكوندريا مختلفة محتملة، بما في ذلك TMRE أو JC-1. فضلا عن الأصباغ الميتوكوندريا الأخرى مثل الميتو تراكر أو ميتو فوكس.
وقد أشير إلى القضايا الحرجة التي ورثتها الأنشطة المختلفة لمضخات الـ efflux بين نخاع العظام مؤخراً فقط. لذا فإن هذا البروتوكول يهدف إلى الحد من التناقض بين النتائج السابقة.
