미토콘드리아 기능은 조혈 줄기 세포 자체 재생에 매우 중요합니다. 미토콘드리아 활성은 내부 미토콘드리아 막 전위의 반사약으로, 이는 세포 형광, 세포-퍼큐릭 양이온염인 TMRM에 의해 측정될 수 있다. 제노바이오틱 efflux 펌프는 HSC에서 매우 활발하며 TMRM 압출을 유발합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은, 베라파밀, efflux 펌프의 억제제를 활용, 이 효과의 보정이다. 마우스 대퇴골에서 골수를 격리하여 시작합니다. 두 개의 후방 발을 잘라 집게와 날카로운 가위를 사용합니다.
그런 다음 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 스트레칭합니다. 대퇴골과 경골을 추출하고 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 뼈를 염색 버퍼 1.5 밀리리터로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다. 뼈에서 근육을 제거하고 뼈의 끝을 잘라 골수가 빠져 나갈 수 있도록합니다.
1.5 밀리리터의 염색 버퍼로 청소된 뼈를 새 우물에 놓습니다. 그런 다음 뼈가 흰색이 될 때까지 3 밀리리터 주사기와 25 게이지 바늘로 골수를 내뿜습니다. 1.5 밀리리터 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 180회 G에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상퍼를 폐기하십시오.
조심스럽게 얼음 차가운 ACK 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단하고, 1 분 동안 얼음에 세포를 넣어. 그런 다음 염색 버퍼의 밀리리터 1밀리리터를 추가하여 즉시 리시스를 비활성화합니다. 180회 G.Resuspend에서 5분 동안 세포를 원심분리하여, 이는 염색 버퍼의 1밀리리터에서 흰색으로 나타나야 합니다.
세포 스트레이너 캡을 사용하여 세포를 필터링하고 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 단핵 세포를 얻습니다. 계보 칵테일을 준비하는 것으로 시작하며, 원고 의 지시에 따라 형광소가 항체를 연상시니다. 항체를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호합니다.
그런 다음 180회 G에서 5분간 시료를 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. 리니지 칵테일의 400 마이크로리터와 CD135 바이오티니드 항체 의 4마이크로리터를 세포 펠릿에 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 그런 다음 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
인큐베이션 후, 염색 버퍼의 3 밀리리터를 추가하고, 180회 G에서 5분간 회전하고, 상체를 폐기하여 샘플을 세척합니다. 그런 다음 항체 용액의 400 마이크로 리터를 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 얼음에 30분 간 배양하고 염색 버퍼로 세척을 반복합니다.
TMRM 염색 용액을 준비하려면 혈청이 없는 혈청 프리 조혈 배양 배지의 1.1 밀리리터에 2.2 마이크로리터의 TMRM 스톡 솔루션과 1.1 마이크로리터를 혈전포이에틴 및 줄기 세포 인자를 첨가하십시오. TMRM 염색 용액의 1 밀리리터에서 골수를 다시 중단하고, 빠르게 소용돌이를 하고, 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 체료를 필터링하여 유동 세포계를 막히는 것을 방지합니다.
그런 다음 DAPI의 마이크로 리터 를 추가하고 흐름 세포 측정을 진행합니다. 골수 샘플을 실행하고 적어도 백만 이벤트를 수집합니다. 그런 다음 살아있는 골수 단핵 세포를 태평양 파란색 플롯에 표시하여 CD135 Lin-negative 및 Lin 양성 분획을 식별합니다.
APC/Cy7 대 PE/Cy7에 대한 린 음성 분획을 플롯하여 다능성 선조 또는 MPP 분획을 식별합니다. 그런 다음 APC 대 PerCP/Cy5.5에 대한 MPP 분획을 플롯하여 조혈 줄기 세포 또는 HSC 분획을 식별합니다. FITC 또는 CD34에 대한 HSC 분획을 표시하여 CD34 음수 HSC 및 CD34 양수 HSC 분획으로 나눕니다.
마지막으로 각 모집단에서 TMRM 강도를 획득합니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하려면 샘플에 FCCP 마이크로리터 1개를 추가하고 1 밀리머의 최종 농도를 위해 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음 백만 개의 이벤트를 획득합니다.
FCCP가 추가된 후 TMRM 강도를 크게 늘려야 합니다. 이 프로토콜은 TMRM 염료를 사용하여 다양한 세포 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 정량화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 배양 배지에서 PBS와 FBS의 존재가 TMRM 신호 강도에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다.
따라서 혈청없는 확장 매체에서 TMRM 염색을 수행하는 것이 중요합니다. 조혈 줄기 세포는 TMRM 염료를 돌출하는 xenobiotic efflux 펌프의 높은 활동 수준을 표현합니다. 따라서 TMRM 프로파일은 펌프를 차단하는 베라파밀 또는 사이클로스포린 H의 존재에도 다릅니다.
TMRM 염색의 정확도를 확인하기 위해 FCCP는 미토콘드리아를 탈극화하고 TMRM 강도를 감소시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 TMRE 또는 JC-1을 포함하여 다른 미토콘드리아 막 잠재적 염료로 HSC를 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있습니다. 뿐만 아니라 미토트래커 또는 미토삭스와 같은 다른 미토콘드리아 염료.
골수 인구 중 efflux 펌프의 다른 활동에 의해 상속 된 중요한 문제는 최근에 지적되었다. 따라서 이 프로토콜은 이전 결과 간의 불일치를 줄이기 위한 것입니다.
