通过抑制Efflux泵,提高造血干细胞和造血细胞中线粒体膜电位流细胞测定的准确性

线粒体功能对造血干细胞自我更新至关重要。线粒体活性是内线粒体膜电位的反射器，可以通过TMM（一种细胞荧光、细胞渗透的阳离子染料）进行测量。异生物流泵在 HSC 中高度活跃，并导致 TMRM 挤出。

该协议的主要优点是纠正这种效果，利用维拉帕米尔，一个抑制的流水泵。首先将骨髓与小鼠股骨隔离。用一把钳子和锋利的剪刀剪下两只后爪。

然后在小鼠的腹皮上做一个小剪贴，然后伸展它。提取股骨和头骨，同时注意不要将股骨的头拔出，将骨骼放在一个六孔板中，里面装满了1.5毫升的染色缓冲液。从骨骼中去除肌肉，切开骨骼的末端，让骨髓退出。

将清洁的骨骼放在新井中，用 1.5 毫升染色缓冲液。然后，用三毫升注射器和25针冲洗出骨髓，直到骨头变白。将所有细胞收集在1.5毫升管中，在180倍G下离心5分钟，然后丢弃上一代。

小心地将颗粒重新放入300微升的冰冷CK开水缓冲液中，将细胞放在冰上一分钟。然后立即通过添加一毫升染色缓冲液来停用解。将细胞在180倍G.重新暂停的细胞颗粒中离心5分钟，该颗粒应显示为白色，在一毫升染色缓冲液中。

使用35微米尼龙网的细胞滤网过滤细胞，获得单核细胞。首先准备血统鸡尾酒，和荧光结合抗体，根据手稿说明。将抗体放在冰上，防止光线。

然后，将样品在 180 倍 G 下离心 5 分钟，然后丢弃上一代。加入400微升的血统鸡尾酒，以及4个微升CD135生物素化抗体到细胞颗粒，并漩涡混合物。然后在冰上孵育30分钟。

孵育后，通过加入三毫升染色缓冲液清洗样品，在180倍G下旋转5分钟，然后丢弃上经剂。然后加入400微升的抗体溶液，并涡旋混合物。在冰上再孵育30分钟，然后用染色缓冲液重复洗涤。

为了准备TMTM染色溶液，添加2.2微升TMTM库存溶液，1.1微升维拉帕米尔，至1.1毫升无血清造血造造培养基，具有血栓波伊汀和干细胞因子。将骨髓重新在TMTM染色溶液的一毫升中，快速旋涡，在37摄氏度下孵育一小时。使用 35 微米尼龙网的细胞滤网盖过滤样品，以避免堵塞流动的环流仪。

然后添加一个微升的DAPI，然后继续进行流式细胞测量。运行骨髓样本，并获取至少一百万个事件。然后在太平洋蓝色图中显示活骨髓单核细胞，以识别CD135林阴和林阳性分数。

绘制 APC/Cy7 与 PE/Cy7 的林负分数，以识别多能祖先或 MPP 分数。然后绘制 APC 与 PerCP/Cy5.5 的 MPP 分数，以识别造血干细胞或 HSC 分数。显示 FITC 的 HSC 分数（CD34）以将其划分为 CD34 负 HSC 和 CD34 正 HSC 分数。

最后获得每个人群的TMM强度。为确保TMTM染色正常工作，在样品中加入一微升FCCP，最终浓度为1毫摩尔，并在37摄氏度下孵育5分钟。然后获取一百万个事件。

添加 FCCP 后，应大幅提高 TMRM 强度。该协议已成功用于用TMTM染料量化各种细胞群中的线粒体膜电位。已经证明，PBS和FBS在培养介质中的存在会影响TMM信号强度。

因此，在无血清扩张介质中进行TMM染色非常重要。造血干细胞表达挤出TMTM染料的异源性排泄泵的高活性水平。因此，TMRM 配置文件在存在 Verapamil 或 Cyclosporin H 时也会有所不同，它们会阻塞泵。

为了验证TMTM染色的准确性，FCCP 可以去极化线粒体，并降低 TMRM 强度。该协议可以很容易地适应研究HSC与不同的线粒体膜电位染料，包括TMR或JC-1。以及其他线粒体染料，如米托跟踪器或米托索克斯。

最近才指出了骨髓群体中流血泵不同活动所继承的重要问题。因此，该协议旨在减少以前发现的差异。