Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.

وقد اهتم الفئران المستخدمة في هذا العمل والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية لمجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EU) لاستخدام الحيوانات المختبرية. 1. إعداد الحلول المطلوبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول الأسهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10X بولي L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) الحل: تزن من 10 ملغ من هيدروبروميد منظمة التحرير الفلسطينية (الوزن الجزيئي = 30،000-70،000) وتذوب في 70 مل من الماء المعقم. تصفية الحل باستخدام حقنة 0.2 ميكرون فلتر، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30٪ الجلوكوز الحل: تزن من 30 غراما من D (+) - الجلوكوز وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعديل المتوسطة النسر Dulbecco ل5X (DMEM) / خليط المغذيات F-12 هام: يزن من 6 غرام من مسحوق DMEM / F-12 هام وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.5٪ بيكربونات الصوديوم (NaHCO 3) Solutiعلى: تزن من 7.5 غرام من NaHCO 3 و تذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M HEPES الحل: وزن من 23.8 غرام من HEPES وتذوب في الماء المعقم إلى إجمالي حجم 100 مل. فلتر، قسامة، وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70٪ (V / V) الايثانول: تمييع 70 مل من الايثانول المطلق مع 30 مل من الماء المعقم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة المالحة مع الجلوكوز والمضادات الحيوية (PBS-الديوان): إضافة 10 مل من محلول الجلوكوز 30٪ و 5 مل من محلول البنسلين الستربتوميسين إلى 500 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة. تخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعطل مصل بقري جنيني (iFBS): مصل بقري ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو إلغاء تشغيله عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قسامة إلى 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة المتوسطة: في الماء المعقم، مزيج تباعا 40 مل من 5X DMEM / F12-هام، 1 مل من 1 M HEPES، 2 مل من 200 ملي L-الجلوتامين، 2 مل من البنسلين، الستربتومايسين، 4 مل من الجلوكوز 30٪ والثانية 3 مل من 7.5٪ NaHCO 3 إلى الحجم النهائي من 180 مل. تصفية وتستخدم في نفس اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هرمون ميكس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 180 مل من مستنبت. حل 200 ملغ من APO-ترانسفيرين في هذه الوسيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 50 ملغ من الأنسولين وتذوب في 2 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 M. إضافة ببطء 8 مل من الماء المعقم في حين خلط بلطف. يخفف هذا الحل في مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 19.3 ملغ من هيدروكلوريد بوتريسين وتذوب في 10 مل من الماء المعقم. إضافة محلول 10 مل إلى المزيج الهرمون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 ملي حل زيلونيت الصوديوم في الماء المعقم والحل البروجسترون 2 مم في الايثانول المطلق. إضافة 20 ميكرولتر من كل حل لمزيج الهرمون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية المزيج الهرموني، قسامة إلى 10 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 2. إعداد لوحات والصكوك الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FBS طلاء لوحات ثقافة: اليوم قبل تشريح، وإعداد 180 مل من مستنبت. إضافة 10 مل منiFBS إلى 90 مل من مستنبت. إضافة 300 ميكرولتر / جيد من مستنبت / 10٪ iFBS في بولي-D-يسين المكسوة مسبقا والمحمولة 24 لوحات جيدا. احتضان ليلا 37 درجة مئوية. تخزين الوسائط المتبقية (مع وبدون iFBS) في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات وماصات باستور. جمع المعدات المدرجة في جدول المواد فضلا عن الدرجة الثانية غطاء تدفق الصفحي وحاضنة CO 2. </li></ol> 3. تشريح الفأر الدماغ المتوسط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية ماوس E13.5 حاملا (وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية). تنظيف البطن من الفأر مع الايثانول 70٪ وفتح جدار البطن. جمع قرون الرحم، فتحها باستخدام مقص الدقيقة، تشريح كل جنين من قرون الرحم، وإزالة الأغشية الذي يحيط بالجنين. وضع الأجنة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على معقم PBS-الديوان وغسلها عن طريق التحويل في 3 حمامات متطابقة المتعاقبة باستخدام ملقط. للتشريح، ووضع الأجنة بنسبة 3 في 60 ملم طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل التحققالبريد طبق بيتري النهائي تحت stereomicroscope. لا قطع رأس الأجنة. باستخدام مقص Vannas، استئصال العقول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وتجاهل المناطق fore- والدماغ المؤخر. إلى الجانب منقاري، وقطع على مقربة من المنطقة المهادية، إلى خفض الجانب الذيلية في منطقة البرزخ، وإزالة أكيمة متفوقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم عزل الدماغ المتوسط ​​البطني، وإزالة السحايا باستخدام ملقط غرامة فائقة بعناية. جمع شرائح تشريح، دون السحايا، في أنبوب معقم 13 مل مليئة PBS-الديوان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الأنبوب الذي يحتوي على mesencephala تماما مع الايثانول 70٪ وجعله تحت غطاء محرك السيارة. </li></ol> التفكك 4. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل mesencephala 3X مع معقم PBS-الديوان. السماح شظايا الدماغ ليستقر بين كل غسل، وتجنب تعطيل الأنسجة. بعد غسل الماضي، وإزالة بعناية بقدر حل ممكن واحتضان شرائح الدماغ في 3 مل من التربسين / EDTA لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية فيCO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النار البولندية ماصات باستور لتعظيم بقاء الخلايا العصبية كما في نهاية الماصة الزجاج غير المصقول هو حاد ويمكن أن تتلف الخلايا خلال الخطوات التفكك. قليلا تقليل قطرها أقصى (0.5 مم) من ماصة باستور بينما النار تلميع ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية بقدر حل التربسين / EDTA ممكن، وإضافة 10 مل من مستنبت / 10٪ iFBS. شرائح الدماغ غسل 3X مع مستنبت / 10٪ iFBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام باستور ماصة مصقول النار، والبدء تفكك mesencephala في 6 مل من الثقافة 10٪ iFBS متوسطة /. يسحن 10X (تجنب فقاعات الهواء)، والسماح للقطع ليستقر، ثم جمع المتوسط ​​في أنبوب جديد معقمة 13 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 مل من مستنبت، كرر الخطوة السابقة مرة واحدة وجمع المتوسط ​​تحتوي على خلايا فصلها في نفس أنبوب 13 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 160 غ لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في مستنبت تستكمل مع10٪ هرمون المزيج. </li></ol> 5. خلية التصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا في تعليق في خلية مالاسيه وضبط حجم المتوسطة إلى تركيز 600،000 خلية / مل. ويمكن الحصول على حوالي 1،700،000 خلايا الدماغ المتوسط ​​واحدة من الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة FBS التي تحتوي على طلاء المتوسطة من 24 لوحات جيدة وإضافة في كل بئر 1 مل من تعليق خلية (600،000 خلية / جيدا، 2-4٪ من خلايا TH +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2/95٪ الهواء. أي تغيير المتوسط ​​أمر ضروري. الخلايا العصبية الدوبامين تنضج بعد حوالي 5-7 أيام في المختبر (التعبير المتسق لنقل الدوبامين). إبقاء الخلايا في الثقافة تصل إلى 15 يوما دون استبدال المتوسط. </li></ol> بروتوكول 6. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنظيف لل coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من تشريح، إضافة 10 مل من 1 M حمض الهيدروكلوريك في طبق بيتري. وضع على سطح السائل 12-15 coverslips الزجاج وانتظر 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغرق غطاءتنزلق إلى السائل والانتظار لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حمض الهيدروكلوريك وغسل 3X مع الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لل coverslips بسرعة مع الإيثانول النقي مرة واحدة، ثم تضاف الإيثانول النقي إلى الطبق وانتظر لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة، وإزالة coverslips تنظيفها من الإيثانول وإضافة 1 ساترة لكل بئر من 12 لوحة جيدا ثقافة الخلية باستخدام ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مرتين مع الماء المعقم (1 مل / جيد). ثم، غسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء لل coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر / جيد من 2X منظمة التحرير الفلسطينية (المخفف في PBS). احتضان لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل منظمة التحرير الفلسطينية وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر / جيد من 20٪ iFBS / 1 جم / مل Laminin. احتضان ليلا 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء الخلايا لالمناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طلاء المتوسطة من 12 لوحات جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900،000 خلية / جيدا في حجم 2 مل وتنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. يمكن أن تظل الخلايا في الثقافة تصل إلى 15 يوما دون استبدال المتوسط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة من 12 لوحات جيدا ويغسل مع 500 ميكرولتر / جيد مسخن DMEM عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مسخن 500 ميكرولتر / جيد من DMEM عند 37 درجة مئوية، ثم تضاف برفق 160 ميكرولتر / جيد من 8٪ بارافورمالدهيد (PFA، 2٪ تركيز النهائي)، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PFA وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / 0.1 M جليكاين لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من PBS / 0.05٪ تريتون X-100/20٪ الماعز المصل واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBS / 0.05٪ تريتون X-100 / بنسبة 1٪ مصل الماعز واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يشار إلى الأجسام المضادة الأولية التي يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين وتوصيف الثقافة في الجدول المواد. إبقاء1 جيدا دون الأجسام المضادة الأولية لتقييم للخلفية الأجسام المضادة الثانوية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / الجيلاتين 0.2٪ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، إضافة 300 ميكرولتر / جيد من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في PBS / 0.05٪ تريتون X-100 / بنسبة 1٪ مصل الماعز واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام. يشار إلى الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في جدول المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني / الجيلاتين 0.2٪ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل لل coverslips على جانب الزجاج خلية الشرائح أسفل في قطرة من VECTASHIELD. الحفاظ على الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح للجفاف المتوسط ​​المتصاعدة، ثم تخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور باستخدام مجهر متحد البؤر المجهر أو على النقيض من المرحلة مجهزة لepifluorescence. تم الحصول على صور تمثيلية مع المجهر مبائر ايكا SP2 الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum.">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li><li>Iversen, S. D., Iversen, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+50+years+in+perspective.">Dopamine: 50 years in perspective.</a> Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).</li><li>Dahlstroem, A., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Existence+of+Monoamine-Containing+Neurons+in+the+Central+Nervous+System+I.+Demonstration+of+Monoamines+in+the+Cell+Bodies+of+Brain+Stem+Neurons.">Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons.</a> Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).</li><li>Chinta, S. J., Andersen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons.">Dopaminergic neurons.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).</li><li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+systems+in+the+brain:+an+update.">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li><li>Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons:+a+review+of+the+molecular+circuitry+that+regulates+their+development.">Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development.</a> Dev Biol. 379, 123-138 (2013).</li><li>Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 363, 1783-1793 (2004).</li><li>Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mTOR+signaling+in+Parkinson's+disease+prevents+L-DOPA-induced+dyskinesia.">Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia.</a> Sci Signal. 2, (2009).</li><li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain:+implications+for+the+development+of+dyskinesia.">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li><li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+pieces+in+the+Parkinson's+disease+puzzle.">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li><li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson's+disease.">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive:+implication+for+Parkinson+disease.">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li><li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li><li>Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28, 24-30 (2013).</li><li>di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+striatal+cells+on+in+vitro+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurones+grown+in+serum-free+conditions.">Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions.</a> Nature. 288, 370-373 (1980).</li><li>Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+heterogeneity+may+define+the+three-dimensional+shape+of+mouse+mesencephalic+dopaminergic+neurones.">Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones.</a> Nature. 307, 641-643 (1984).</li><li>Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons.">In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).</li><li>Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+toxicity+toward+cultured+mesencephalic+dopaminergic+neurons+is+induced+by+the+synergistic+effects+of+energetic+metabolism+impairment+and+NMDA+receptor+activation.">A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation.</a> J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).</li><li>Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+in+culture+by+low-level+stimulation+of+voltage-gated+sodium+channels.">Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels.</a> J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).</li><li>Toulorge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+midbrain+dopamine+neurons+by+nicotine+is+gated+by+cytoplasmic+Ca2.">Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2.</a> FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).</li><li>Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Iron-Binding+Protein+Lactoferrin+Protects+Vulnerable+Dopamine+Neurons+from+Degeneration+by+Preserving+Mitochondrial+Calcium+Homeostasis.">The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis.</a> Mol Pharmacol. 84, (2013).</li><li>Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitriol+imparts+neuroprotection+in+vitro+to+midbrain+dopaminergic+neurons+by+upregulating+GDNF+expression.">Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression.</a> PLoS One. 8 (e62040), (2013).</li><li>Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I+inhibition+is+not+required+for+dopaminergic+neuron+death+induced+by+rotenone,+MPP+,+or+paraquat.">Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).</li><li>Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mouse+models+of+neurodegenerative+diseases.">Genetic mouse models of neurodegenerative diseases.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).</li><li>Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+microglial+NADPH+oxidase-derived+free+radicals+in+the+in+vitro+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease.</a> FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Parkinson's+disease-related+mutant+alpha-synuclein+in+the+midbrain+dopaminergic+neurons+causes+progressive+neurodegeneration+and+degradation+of+transcription+factor+nuclear+receptor+related+1.">Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1.</a> J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).</li><li>Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+dating+of+midbrain+dopamine+neurons+identifies+A9+enriched+tissue+for+transplantation+into+parkinsonian+mice.">Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice.</a> Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).</li><li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+loss,+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2.">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li><li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+axon+guidance:+which+makes+what.">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li><li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li><li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner.">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li><li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture:+morphology+and+electrophysiology.">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li><li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons:+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry.">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يعرض هذا البروتوكول الإجراءات والكواشف اللازمة لإعداد ثقافة الأولية من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​من الفأر الجنينية وإجراءات المناعي للكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين. الخطوات الحاسمة من الإجراء هي تشريح الأجنة والتفكك الميكانيكي للشظايا الدماغ التي تم ?...

الدوبامين، واحدة من الناقلات العصبية في الدماغ الأساسية 1،2، يتم تحريرها أساسا من الدماغ المتوسط ​​الدوبامين (DA) الخلايا العصبية. غالبية الخلايا العصبية DA يقيمون في الجزء البطني من الدماغ المتوسط ​​2-6. تخطيطي، DA الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​ويمكن تقسيم في ثلاثة تشريحيا ووظيفيا أنظمة متميزة الإسقاط: mesostriatal، mesolimbic، ومسارات mesocortical 2،5. ويشارك المسار السوداوي المخططي في السلوك الحركي، ومسارات mesolimbic تلعب دورا هاما في تعزيز، والدافع، والتعلم، في حين أن مسارات الدوبامين إسقاط لقشرة الفص الجبهي وتورط في الإدراك 2. وتشارك الخلايا العصبية DA في العديد من الاضطرابات العصبية البشرية مثل الفصام ونقص الانتباه واضطراب فرط النشاط، ومرض باركنسون (PD) 2،4. يتميز PD من قبل انحطاط تدريجي وانتقائي من الخلايا العصبية DA ربط المادة السوداءبارس المكتنزة (SNC) إلى المخطط. فقدان الخلايا العصبية DA النتائج nigro الجسم المخطط في نضوب الدوبامين شديد في المخطط هي المسؤولة من الأعراض الحركية من PD (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة) 7. لم تثبت السبب الأولي للPD مجهول السبب والعلاجات الحالية هم أعراض فقط، وتهدف إلى استعادة مستوى الدوبامين في الجسم المخطط. الدواء الأكثر المقررة هي L-دوبا (يفودوبا)، من المكونات الطبيعية للدوبامين. وإن إدارة يفودوبا يعوض عن فقدان الدوبامين لفترة معينة، تحدث مضاعفات المحرك بعد العلاج على المدى الطويل (خلل الحركة وعلى / قبالة المتحدة) 8،9. الأبحاث على الخلايا العصبية الدوبامين وPD هو في تطور مستمر وتبذل جهود مكثفة لتطوير العلاجات على أساس زرع الخلايا، والعلاج الجيني، أو وكلاء اعصاب 10،11. ومع ذلك، تبقى قضية رئيسية غير توضيح: ما هو سبب vulnerab المدقعility من الخلايا العصبية DA؟ جزء من الجواب يمكن العثور عليها في نشاط الخلايا العصبية DA. ويبدو أن الانخفاض في النشاط الكهربائي واستثارة الخلايا العصبية DA لزيادة ميلها لتتحول 12. ومع ذلك، فإن تعقيد PD المرضية يتطلب المزيد من الدراسات لتحديد الآليات التي تشارك في الخلايا العصبية DA انحطاط 13-15. الثقافات الأولية هي ذات الصلة وخاصة لدراسة خصائص الخلايا العصبية DA 16-19 وتحدي هذه الخلايا العصبية لمختلف الضغوط لتقييم وكلاء اعصاب 20-24. وغالبا ما تستخدم نماذج الثقافة الفئران، حيث أن تشريح الجنين الفئران الدماغ المتوسط ​​هو أسهل، مقارنة مع الماوس، ويمكن الحصول على كميات أكبر من الخلايا العصبية في الفئران. ومع ذلك، وتوليد نماذج الماوس المعدلة وراثيا للمرض 25 قد ازداد بشكل ملحوظ في مصلحة المجتمع الأعصاب للثقافات الأولية من الماوس 26-29. على الرغم من الثقافات والعلاقات العامةepared من الحيوانات حديثة الولادة يمكن استخدامها، فمن الأفضل لإعدادهم من أجنة في مرحلة ما بعد الإنقسامية (E13.5 للعصبونات الدماغ المتوسط)، عندما الاحتفاظ الخلايا العصبية قدرتها على تمييز. يقدم البروتوكول التالية الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​المعزولة في الثقافة الأولية من أجنة الفئران (E13.5)، والتي هي الأكثر صعوبة للاستعداد. خصوصا، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام المصل خالية مستنبت لاستنساخ أفضل. الخطوات الأكثر أهمية اثنين في إعداد ثقافة (تشريح والتفكك الميكانيكي) سيتم تفصيله بعناية في الفيديو المرتبطة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1291">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine, 200 mM Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D0547</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Laminin - 1 mg/mL in Tris buffered NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">H4034&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">G7126</td>
			<td>Stock solution 1M in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">G9391</td>
			<td>Stock solution 2% (w/v) in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:139px;">T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% in water</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:139px;">RT 15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:139px;">106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D(+)-Glucose, Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>4074-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:139px;">109057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sterile water - Aqua B. Braun</td>
			<td style="width:176px;">Braun</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:139px;">20821.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Sterile Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Counting chamber Malassez</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:139px;">631-0975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 &#181;m, 37 mm</td>
			<td>PALL Life science</td>
			<td style="width:139px;">4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long</td>
			<td style="width:176px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>To open the abdominal wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>4877A</td>
			<td>To open the uterine wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>2183</td>
			<td>To manipulate embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>MC50</td>
			<td>To take out the mesencephalon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long</td>
			<td style="width:176px;">MORIA</td>
			<td>9987</td>
			<td>To remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td style="width:139px;">356414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td style="width:139px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90&#186;</td>
			<td>MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td style="width:139px;">AG00008032E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm &#216;</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt&#160;</td>
			<td>Chemicon Millipore</td>
			<td>MAB369</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum, New Zealand Origin</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">A-31556</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11007</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss microscopy</td>
			<td>Stemi-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:507px;">Bunsen Burner FIREBOY</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">451-0136</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of mouse dopaminergic neurons

الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا العصبية في الدماغ. هذه كمية قليلة من الخلايا العصبية في الدماغ وينظم وظائف مهمة مثل التحكم في المحركات، والدافع، والذاكرة العاملة. الخلايا العصبية الدوبامين السوداوي المخططي تتدهور بشكل انتقائي في مرض باركنسون (PD). ويرتبط هذا فقدان الخلايا العصبية التقدمية بشكل لا لبس فيه مع المحركات أعراض أمراض (بطء الحركة، ويستريح ورعاش، وصلابة العضلات). الوكيل الرئيسي المسؤول عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين لا يزال مجهولا. ومع ذلك، يبدو أن هذه الخلايا العصبية عرضة للغاية في ظروف متنوعة. الثقافات الأولية تشكل واحدة من أكثر النماذج ذات الصلة للتحقيق خصائص وخصائص الخلايا العصبية الدوبامين. ويمكن تقديم هذه الثقافات إلى مختلف العوامل الإجهاد التي تحاكي PD علم الأمراض والمركبات اعصاب من أجل وقف أو إبطاء تدهور الخلايا العصبية. العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من PD التي كانت GENERated خلال العقد الماضي زادت مصلحة الباحثين عن الثقافات الخلايا العصبية الدوبامين. هنا، يركز بروتوكول الفيديو على تشريح دقيق من أدمغة فئران جنينية. الاستئصال الدقيق للبطني الدماغ المتوسط ​​أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات العصبية غنية بما فيه الكفاية في خلايا الدوبامين للسماح دراسات لاحقة. يمكن تحقيق هذا البروتوكول مع الفئران المعدلة وراثيا الجنينية ومناسبة لتلطيخ المناعي، PCR الكمي، الثاني الكمي رسول، أو الخلايا العصبية تقييم الموت / بقاء.

ويظهر على الرسم البياني يتضح من الخطوات الثقافة الدماغ المتوسط ​​في الشكل رقم 1. فترة وجيزة، بعد جمع الأجنة E13.5 من الفأر السويسري حاملا، يتم تشريح الدماغ المتوسط ​​البطني من الجنين بأكمله. وتقدم شظايا الدماغ معزولة تباعا لعملية الهضم الأنزيمي والتفكك الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons at JoVE.com

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

37.3K Views.  Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier. Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Video: Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

وضع العلامات البالستية للخلايا العصبية الهرمية في شرائح الدماغ وفي ثقافة الخلايا الأولية

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.