يمكن استخدام بروتوكولنا لإنتاج الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم من الخلايا الجذعية الجنينية التي تعبر عن عامل التحفيز المناعي ، GM-CSF. الحويصلات المخصبة خارج الخلية التي تحمل GM-CSF ، لديها القدرة على خدمة الحويصلات التنظيمية المناعية الخالية من الخلايا التي يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية. الباحثون مع التدريب البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأساسية، ينبغي أن تكون قادرة على بسهولة كما يمكن لهذا البروتوكول، ولكن أي شخص ينفذ هذا البروتوكول للمرة الأولى يجب أن تتبع التوجيهات عن كثب.
نظرا لأن بروتوكولنا معقد ، فإن تصور التفاصيل المعقدة لكل خطوة سيساعد الباحثين الآخرين على توليد FBS مجانية إكسوسوم ، والطرد الفائق الحجم المطلوب من FBS وجمع supernatant الحرة exosome. قبل طلاء الخلايا الثلاث ESD، معطف 15 سم أطباق زراعة الأنسجة مع 0.1٪الجيلاتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إزالة الجيلاتين عن طريق الطموح والثقافة ESD ثلاث خلايا دون خلايا طبقة التغذية في ESD ثلاث خلايا ثقافة المتوسطة في 37 درجة مئوية في 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطوبة حتى تصل الخلايا 90٪ التقاء.
غسل الثقافات التقاء تقريبا مع خمسة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين لكل طبق تليها حضانة خمس دقائق في 37 درجة مئوية في تريبسين الطازجة. في نهاية الحضانة سحب الخلايا المنفصلة في أنبوب الطرد المركزي وتعطيل التريبسين مع خمسة ملليلتر من المتوسطة ثقافة جديدة. ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق المنصات في وسط جديد لعد للتمرير، لوحة خمس مرات 10 إلى السادس من ESD ثلاث خلايا في 15 ملليلتر من الخلايا ثقافة المتوسطة على لوحات جديدة مغلفة الجيلاتين لمدة ثلاثة أيام من الثقافة قبل زراعة الخلايا الفرعية لجمع الخلايا الثقافة الفائقة لعزل لوحة الحويصلات خارج الخلية المخصب exosome مرة واحدة 10 إلى ESD السابعة ثلاث خلايا في 15 ملليلتر من خلية الثقافة المتوسطة لكل لوحة جديدة مغلفة الجيلاتين لمدة ثلاثة أيام قبل جمع الشعيرات ثقافة الخلية ل exosome المخصب عزل الحويذ الخلوية اضافية، أولا الرواسب شظايا الخلية الكبيرة داخل الشعيرات التي تم جمعها من 72 ساعة مثقف ESD ثلاث خلايا عن طريق الطرد المركزي.
بعد جمع supernatant، Ultracentrifuge العينات والتخلص من المضادات الفائقة. شطف بلطف كل pallette مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل لإزالة أي ثقافة المتبقية supernatant وتحديد محتوى بروتين الحويكل المخصب exosome مع مقايسة حمض بيسينونيتيك، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم إعادة تعليق الحويصلات المخصبة exosome خارج الخلية في برنامج تلفزيوني في ستة ميكروغرام لكل تركيز متر صغير للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية.
لتصور الحويصلات خارج الخلية المخصبة عن طريق إرسال المجهر الإلكتروني إصلاح ثلاثة إلى خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من الحويصلات خارج الخلية مع التركيز النهائي من 2٪ المجهر الإلكتروني شبكة paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، قم بتحميل 10 ميكرولترات من العينات الثابتة على شبكات النحاس مع فيلم دعم الكربون لمدة دقيقة واحدة قبل استنزاف الشبكات بورق التصفية، والبقاء في الشبكات مع محلول تلطيخ مناسب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واستخدام الملاقط لنقل الشبكات إلى قطعة من ورق التصفية، ثم استخدم المجهر الإلكتروني الإرسال مع التكبير 50،000 مرة للحصول على صور المجهر الإلكتروني، وفقا للبروتوكولات القياسية. لإعداد مستخلصات الخلية الكاملة، وجمع ESD ثلاث خلايا من الثقافة كما هو موضح، وإعادة تعليق الخلايا المحصودة في برنامج تلفزيوني للعد.
بعد الطرد المركزي الثاني، إعادة تعليق الخلايا من أصل خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل ميكرولتر من المخزن المؤقت تحميل صفحة SDS التي تحتوي على تركيز 0.5٪ SDS وسونيكاتي العينات لمدة 10 ثوان على Sonicator مع سعة 10٪. ثم سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لإعداد الليسات للحوافات المخصبة خارج الخلية ، أعد تعليق الحويصلات المخصبة خارج الخلية في مخزن تحميل صفحة SDS الذي يحتوي على 0.5٪ SDS بمعدل 1.2 ميكروغرام لكل تركيز ميكروليتر و Sonicate العينات لمدة 10 ثوان كما هو موضح ثم سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
لتحليل بلوت الغربية، تحميل 10 ميكرولتر استخراج الجملة وإكسوسوم المخصب عينات lysicle خارج الخلية في الآبار الفردية من هلام صفحة الإجهاد أفضل. في نهاية الشوط ، نقل البروتينات على أغشية PVDF واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة ذات الاهتمام ، ثم الكشف عن التعبير البروتين باستخدام عدة الكشف عن chemiluminescence المحسنة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتقييم كمية من GM-CSF داخل الحويصلات المخصب exosome خارج الخلية، استخدام مجموعة مورين GM-CSF لمعطف لوحة ELISA مع المضادة GM-CSF التقاط الأجسام المضادة المقبل, علاج 0.6 ميكروغرام من عينات الحويصلات المخصب exosome خارج الخلية مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحده, أو PBS زائد 0.05٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة، إضافة عينات المعالجة إلى الآبار الفردية من لوحة ELISA المعدة لمدة ساعة واحدة الحضانة في درجة حرارة الغرفة تليها غسل الآبار المقابلة المناسبة مع برنامج تلفزيوني وحده، أو برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.05٪ توين 20. بعد الغسيل ، أضف الجسم المضاد للكشف إلى العينات لمدة ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة تليها غسل مع PBS وحده أو PBS بالإضافة إلى 0.05٪ توين 20 كما هو موضح ، ثم أضف Avidin Horseradish Peroxidase إلى العينات لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، يليه غسل وقياس الامتصاص في كل بئر على قارئ ميكروبليت في 450 نانومتر. كثافة الفلورية GFP من GM-CSF التعبير عن ESD خط الخلية ثلاثة أو خط الخلية ESD ثلاثة التعبير عن ناقل فارغ هو أعلى بكثير من نظرائهم الوالدين.
ELISA يكشف أن ESD ثلاث خلايا تعبر عن GM-CSF تنتج مستويات أعلى بشكل ملحوظ من GMCSF في ثقافة الخلية supernatant من القيام خلايا مكافحة ناقلات فارغة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الخلايا الليفية المعدلة وراثيا-CSF التي تولدها GM-CSF التي تعبر عن ثلاث خلايا ESD مماثلة لتلك التي تنتجها الخلايا الليفية STO التي تعبر عن GM-CSF. يكشف المجهر الإلكتروني الإرسالي لل الحويصلات خارج الخلية المعزولة عن ناقلات الخلايا المنقولة وثقافات الخلايا المنقولة GM-CSF عن الحويصلات ذات الأحجام المختلفة التي تقع ضمن نطاق قطر 30 إلى 100 نانومتر المتوقع.
يتم تعزيز التعبير عن علامات اكسوسومال، بما في ذلك CD81، Annexin الخامس وflotillin-1 بشكل ملحوظ في الحويصلات خارج الخلية، معزولة عن ESD ثلاث خلايا مقارنة مع مقتطفات الجملة المقابلة من قبل تحليل لطخة الغربية. الأهم من ذلك، لم يتم الكشف عن وجود علامات المقصورة الفرعية الخلوية الأخرى في ESD ثلاثة الحويصلات خارج الخلية المشتقة بما في ذلك علامة الشبكية الانبوبلازمية، البروتين ديسولفيد إيزوميراز، وعلامات الميتوكوندريا، سيتوكروم C وأوكسيفوس المعقدة IV-subunit IV وعلامة السيتوسوليك GAPDH. بعد الغسيل مع 0.05٪ توين 20، تم تخفيض مستويات GM-CSF الخلفية التي تم الكشف عنها في الحويصلات خارج الخلية التحكم بشكل كبير.
وعلى النقيض من ذلك، زادت مستويات GM-CSF في الحويصلات خارج الخلية من الخلايا المعبرة عن GM-CSF بشكل كبير بمقدار توين 20. الحصول على نوعية عالية exosome المخصب الحويصلات خارج الخلية تحمل GMCSF هو الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول. يمكن للباحثين إجراء تجارب إضافية، مثل الدراسات في خطوط الخلايا التابعة GM-CSF والحيوانات لتحديد ما إذا كان الحويصلات المخصبة خارج الخلية التي تهتم ب GM-CSF يمكن أن تعمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية الخالية من الخلايا.
يمكن بعد ذلك استخدام هذه الحويصلات المخصبة خارج الخلية لاستكشاف كيفية تأثير تعديل الاستجابة المناعية على حالات مرضية مختلفة.
