هذا بروتوكول بسيط وفعال من حيث الوقت لعزل وتركيز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة. من السهل اعتماد هذه التقنية في معظم المختبرات لأنها مقياس منضدة ولا تتطلب سوى أدوات بسيطة للعمليات. لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، نوصي بزراعة الخلايا على نطاق واسع للحصول على ما لا يقل عن مائة مليون خلية.
على الرغم من أن الأمر يبدو بسيطا ، إلا أن بعض الخطوات الحاسمة لهذه التقنية يتم إبلاغها بشكل أفضل من خلال العرض المرئي. نأمل أن يتمكن الباحثون من التعلم من تجربتنا وإتقان المهارات بثقة. سيرشدك طالب الدكتوراه لدينا ، السيد تشان ، هونغ هاو ، خلال تجربتنا في عزل وتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة.
للبدء ، قم بطرد مركزي الوسط المكيف عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. جمع وتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات أكبر من 220 نانومتر. شغل وحدة تصفية الطرد المركزي مع 30 ملليلتر من 0.2 ميكرومتر المالحة المفلترة الفوسفات المخزنة.
ثم أجهزة الطرد المركزي وحدة تصفية الطرد المركزي في 3،500g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. أضف 70 ملليلتر من الوسط المكيف المصفى إلى وحدة تصفية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي للوحدة عند 3،500 جرام عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. أضف 30 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وجهاز طرد مركزي للوحدة عند 3،500 جرام عند أربع درجات مئوية. قم بتركيب كوب تجميع مركز على وحدة المرشح وأجهزة الطرد المركزي العكسية عند 1،000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية للحصول على الحويصلات الصغيرة النقية خارج الخلية.
قم بتصفية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. نقل العينات إلى أنابيب جديدة وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. لبدء تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، قم بتخفيف الخلايا الجذعية الوسيطة المعزولة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات إلى 20 إلى 100 جسيم لكل إطار.
أدخل ملليلتر واحد من العينة المخففة في الغرفة المضادة لل A باستخدام محاقن واحدة يمكن التخلص منها. اضبط إعدادات القياس وفقا لذلك. اضبط مستوى الكاميرا على المستوى 14.
لكل قياس ، انقر فوق القياس القياسي واضبط التخفيف وفقا لذلك. بعد ذلك ، انقر فوق التقاط ، وابدأ تشغيل الكاميرا ، واضبط مستوى الكاميرا على 14 لتصور المركبات الكهربائية الصغيرة. لبدء القياس، انقر على إنشاء، ثم انقر على تشغيل البرنامج النصي، وحدد الموقع الذي تريد حفظ الملفات فيه.
أدخل التفاصيل الضرورية للعينة وانقر فوق موافق. انقر فوق الإعداد موافق لمتابعة البرنامج النصي وانقر فوق موافق لبدء القياس. بمجرد تسجيل القياس ، قم بتحليل النتائج باستخدام عتبة اكتشاف من خمسة لتشمل 10 إلى 100 تقاطع أحمر لكل إطار. ويقتصر عدد التقاطع الأزرق على خمسة.
انقر فوق إعداد موافق لمتابعة البرنامج النصي وبدء التحليل. انقر فوق موافق في إشعار البرنامج النصي الكامل والتصدير لتصدير البيانات إلى الموقع المحدد. تحلل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية مع مخزن تحلل تحلل المقايسة المناعية الإشعاعية الباردة والاحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
اجمع المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. حدد كمية البروتين باستخدام مقايسة BCA. قم بتجميع مجموعة الرحلان الكهربائي للهلام وفقا لذلك وقم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عند 90 فولت حتى يصل البروتين إلى نهاية جل التراص.
قم بتغيير الجهد إلى 200 فولت لفصل البروتينات حتى نهاية هلام الحل. قم بإجراء نقل شبه جاف لنقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين عند 15 فولت لمدة ساعة واحدة. سد غشاء PVDF مع 3٪ ألبومين مصل البقر في محلول ملحي مخزن بنسبة 0.1٪ توين 20 لمدة ساعة واحدة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع اهتزاز مستمر. في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF خمس مرات وخمس دقائق لكل منهما باستخدام TBST واحتضانه بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة مع التحريك في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل غشاء PVDF باستخدام TBST خمس مرات وتصور الغشاء في جهاز تصوير مقترن بالشحنة باستخدام كاشف الكشف الكيميائي المضيء.
تحليل مستوى التعبير عن البروتينات باستخدام برنامج ImageJ. أولا ، افتح ملف الصورة في ImageJ. قم بتحسين جودة الصورة عن طريق ضبط السطوع والتباين.
اضبط الصورة حتى تصبح البقع مرئية بوضوح. انقر فوق الزر "تطبيق" واحفظ الصور بتنسيق TIFF. للتحليل القائم على المجهر الإلكتروني النافذ ، قم بتخفيف جزء واحد من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري ، عينة حويصلات صغيرة خارج الخلية بأربعة أجزاء من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المصفى إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر واحتضانها على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون لمدة 15 دقيقة.
قم بإزالة العينة الزائدة باستخدام مناديل معملية واتركها تجف في الهواء لمدة ثلاث دقائق. احتضان 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونجستيك 1٪ لتلطيخ العينة لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة محلول حمض الفوسفوتونجستيك الزائد بنسبة 1٪ باستخدام مناديل معملية واتركه يجف في الهواء لمدة ثلاث دقائق للتصوير تحت المجهر الإلكتروني النافذ.
الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري الحويصلات الصغيرة خارج الخلية لها وضع حجم جسيم يبلغ 53 نانومتر ، في حين أن القمم المهمة الأخرى لحجم الجسيمات كانت 96 و 115 نانومتر. كان تركيز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري التي تم قياسها بواسطة NTA 7.75 في 10 إلى 10 جسيمات لكل ملليلتر. كان تركيز البروتين للحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري والتي تم قياسها باستخدام مقايسة BCA حوالي 80 ميكروغرام لكل ملليلتر.
في تحليل النشاف الغربي ، أظهرت الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101 ، لكنها كانت سلبية ل GRP94. تم تصور الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الحبل السري البشري المعزول تحت TEM لتحديد حجمها ومورفولوجيتها. الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري البشري حويصلات صغيرة خارج الخلية بحجم 100 نانومتر تقريبا وأظهرت بنية غشاء ثنائية الطبقة تشبه الكأس.
مع التطوير الناجح للبروتوكول ، يمكننا الآن الكشف عن الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من حويصلات صغيرة خارج الخلية في الأدوية التجديدية.
