Nuestro protocolo se puede utilizar para producir vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas de alta calidad a partir de células madre embrionarias que expresan el factor inmunoestimuldor, GM-CSF. Las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan GM-CSF, tienen el potencial de servir a las vesículas reguladoras inmunes libres de células que pueden modular la respuesta inmune. Los investigadores con la formación básica en biología molecular y celular, deberían ser capaces de fácilmente como podría ser este protocolo, pero cualquiera que realice este protocolo por primera vez debe seguir las instrucciones de cerca.
Dado que nuestro protocolo es complicado, visualizar los intrincados detalles de cada paso ayudará a otros investigadores a generar FBS libre de exosomas, ultracentrífugo el volumen deseado de FBS y recolectar el sobrenadante libre de exosomas. Antes de emplatar la ESD tres células, cubra los platos de cultivo de tejidos de 15 centímetros con gelatina al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Eliminar la gelatina por aspiración y cultivar las tres células ESD sin células de capa alimentadora en ESD tres medios de cultivo celular a 37 grados centígrados en incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcancen el 90% de confluencia.
Lave los cultivos casi confluentes con cinco mililitros de tripsina al 0,05% por plato, seguido de una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados en tripsina fresca. Al final de la incubación, tire de las células separadas en un tubo de centrífuga e inactive la tripsina con cinco mililitros de medio de cultivo fresco. Sedimentar las células por centrifugación y volver a suspender los palets en medio fresco para el conteo Para el paso, placa cinco veces 10 a la sexta de la ESD tres células en 15 mililitros de medio de cultivo celular en nuevas placas recubiertas de gelatina durante tres días de cultivo antes de subcultivar las células Para recolectar el sobrenadante de cultivo celular para el aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas placa una vez 10 a la séptima ESD tres células en 15 mililitros de medio de cultivo celular por nueva placa recubierta de gelatina durante tres días antes de recolectar los sobrenadantes de cultivo celular Para el aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, primero sedimentar los fragmentos celulares grandes dentro de los sobrenadantes recolectados de tres células ESD cultivadas durante 72 horas por centrifugación.
Después de recolectar el sobrenadante, ultracentrifupe las muestras y deseche los sobrenadantes. Enjuague suavemente cada paleta dos veces con un mililitro de PBS por lavado para eliminar cualquier sobrenadante de cultivo residual y cuantificar el contenido de proteína de vesícula extracelular enriquecida con exosomas con un ensayo de ácido bicinconínico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego vuelva a suspender las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas en PBS a una concentración de seis microgramos por micro metro para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.
Para visualizar las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión, fije de tres a cinco microgramos por mililitro de las vesículas extracelulares con la concentración final de paraformaldehído de rejilla de microscopio electrónico al 2% a temperatura ambiente durante dos horas. Al final de la incubación, cargue 10 microlitros de las muestras fijas en rejillas de cobre con película de soporte de carbono durante un minuto antes de drenar las rejillas con papel de filtro, permanezca en las rejillas con una solución de tinción adecuada, de acuerdo con el protocolo del fabricante y use pinzas para transferir las rejillas a un trozo de papel de filtro, luego use el microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 50, 000 veces para adquirir imágenes de microscopía electrónica, de acuerdo con los protocolos estándar. Para preparar extractos de células enteras, recoja tres células ESD del cultivo como se ha demostrado y vuelva a suspender las células cosechadas en PBS para su conteo.
Después de una segunda centrifugación, vuelva a suspender las celdas de cinco veces 10 a la tercera celda por microlitro de búfer de carga de página SDS que contiene una concentración de SDS de 0.5% y sonice las muestras durante 10 segundos en un Sonicator con una amplitud del 10%. Luego caliente las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Para preparar lisatos para las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, vuelva a suspender las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas en el búfer de carga de páginas SDS que contiene 0.5% SDS a una concentración de 1.2 microgramos por microlitro y sonice las muestras durante 10 segundos como se demostró y luego caliente las muestras a 100 grados Celsius durante cinco minutos.
Para el análisis de Western Blot, cargue 10 microlitros de extracto al por mayor y muestras de lisado de vesícula extracelular enriquecida con exosomas en pozos individuales de un mejor gel de página de estrés. Al final de la carrera, transfiera las proteínas a las membranas de PVDF e incube las membranas con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados de interés, luego detecte la expresión de proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminescencia mejorado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar la cantidad de GM-CSF dentro de las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, use un kit Murine GM-CSF para recubrir una placa ELISA con anticuerpos de captura anti GM-CSF a continuación, trate 0.6 microgramos de muestras de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas con 100 microlitros de PBS solo, o PBS más 0.05% tween 20 a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Al final de la incubación, agregue las muestras tratadas a los pozos individuales de la placa ELISA preparada durante una incubación de una hora a temperatura ambiente seguida del lavado de los pozos correspondientes apropiados con PBS solo, o PBS más 0.05% tween 20. Después del lavado, agregue el anticuerpo de detección a las muestras durante una incubación de una hora a temperatura ambiente seguida de un lavado con PBS solo o PBS más 0.05% tween 20 como se demuestra, Luego agregue Avidin Horseradish Peroxidasa a las muestras para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un lavado y medición de la absorbancia en cada pozo en un lector de microplacas a 450 nanómetros. La intensidad de fluorescencia GFP de una línea celular TRES DE ESD que expresa ESD tres o una línea de tres células de ESD que expresa un vector vacío es mucho mayor que la de sus contrapartes parentales.
ELISA revela que tres células de ESD que expresan GM-CSF producen niveles marcadamente más altos de GMCSF en su sobrenadante de cultivo celular que las células de control de vectores vacíos. Además, la cantidad de GM-CSF generada por GM-CSF que expresa tres células es ESD es similar a la producida por los fibroblastos STO que expresan GM-CSF. La microscopía electrónica de transmisión de vesículas extracelulares aisladas de cultivos celulares transducidos vectoriales y transducidos GM-CSF revelan vesículas de diferentes tamaños que caen dentro del rango esperado de 30 a 100 nanómetros de diámetro.
La expresión de marcadores exosómicos, incluyendo CD81, Annexin V y flotillin-1 se ve notablemente mejorada en vesículas extracelulares, aisladas de tres células ESD en comparación con los extractos mayoristas correspondientes por análisis de Western blot. Es importante destacar que no se detectó la presencia de otros marcadores de compartimento subcelular en ESD tres vesículas extracelulares derivadas, incluido el marcador de retículo endoplásmico, la proteína disulfuro isomerasa, los marcadores mitocondriales, el citocromo C y oxphos complejo IV-subunidad IV y el marcador citosólico GAPDH. Después del lavado con 0,05%tween 20, los niveles de GM-CSF de fondo detectados en las vesículas extracelulares de control se redujeron significativamente.
En contraste, los niveles de GM-CSF en las vesículas extracelulares de las células que expresan GM-CSF aumentaron significativamente en la interpolación 20. La adquisición de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas de alta calidad que transportan GMCSF es el paso más importante para el éxito de este protocolo. Los investigadores pueden realizar experimentos adicionales, como estudios en líneas celulares y animales dependientes de GM-CSF para determinar si las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que cuidan gm-CSF pueden funcionar como vesículas reguladoras inmunes libres de células.
Estas vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas se pueden usar para explorar cómo la modulación de la respuesta inmune afecta diferentes condiciones de enfermedad.
