Nosso protocolo pode ser usado para produzir vesículas extracelulares exosome enriquecidas de alta qualidade a partir de células-tronco embrionárias que expressam o fator estimulante imunológico, GM-CSF. As vesículas extracelulares enriquecidas exósias que carregam GM-CSF têm o potencial de servir a vesículas regulatórias imunológicas livres de células que podem modular a resposta imune. Pesquisadores com o treinamento básico de biologia molecular e celular, devem ser capazes de facilmente, como poderia este protocolo, mas qualquer pessoa que realize este protocolo pela primeira vez deve seguir as instruções de perto.
Como nosso protocolo é complicado, visualizar os detalhes intrincados de cada etapa ajudará outros pesquisadores a gerar FBS livres exosome, ultracentrifuugar o volume desejado de FBS e coletar o supernatante livre exosome. Antes de emplacamento do ESD três células, cubra pratos de cultura tecidual de 15 centímetros com gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a Gelatina por aspiração e cultura a ESD três células sem células de camada alimentadora em ESD três culturas celulares média a 37 graus Celsius em 5% Dióxido de carbono umaidificado incubadora até que as células atinjam 90% de confluência.
Lave as culturas quase confluentes com cinco mililitros de 0,05% de trippsina por prato seguido de uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius em trippsina fresca. No final da incubação puxe as células separadas em um tubo de centrífuga e inativa a trippsina com cinco mililitros de meio de cultura fresca. Sedimentar as células por centrifugação e suspender as paletes em meio fresco para contar para a passagem, placa cinco vezes 10 a o sexto do ESD três células em 15 mililitros de cultura celular meio em novas placas revestidas de gelatina para três dias de cultura antes de sub-cultivar as células Para coletar a cultura celular supernatante para o isolamento de placa de vesículas extracelular enriquecida um vezes 10 para o sétimo ESD três células em 15 mililitros de cultura celular médio por nova placa revestida de gelatina por três dias antes de coletar os supernacantes da cultura celular Para o isolamento extra de vesícula celular enriquecido, primeiro sedimentar os fragmentos de células grandes dentro dos supernantes coletados de 72 horas cultivadas ESD três células por centrifugação.
Depois de coletar o supernascido, ultracentrifuugar as amostras e descartar os supernantes. Enxágue suavemente cada palette duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem para remover qualquer supernanato de cultura residual e quantificar o teor exósiado de proteína vesícula extracelular com um ensaio de ácido bicinchonínico, de acordo com a instrução do fabricante. Em seguida, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em PBS a uma concentração de seis microgramas por micrometro para armazenamento a menos 80 graus Celsius.
Para visualizar as vesículas extracelulares enriquecidas exósias por microscopia eletrônica de transmissão fixe três a cinco microgramas por mililitro das vesículas extracelulares com a concentração final de paraformaldeído de rede de microscópio de 2% a temperatura ambiente por duas horas. No final da incubação, carregue 10 microlitadores das amostras fixas em grades de cobre com película de suporte de carbono por um minuto antes de drenar as grades com papel filtro, fique nas grades com uma solução de coloração adequada, de acordo com o protocolo do fabricante e use pinças para transferir as grades para um pedaço de papel filtro, em seguida, use o microscópio eletrônico de transmissão com uma ampliação de 50.000 vezes para adquirir imagens de microscopia eletrônica, de acordo com os protocolos padrão. Para preparar extratos celulares inteiros, colete ESD três células da cultura como demonstrado, e suspenda as células colhidas na PBS para contagem.
Após uma segunda centrifugação, suspenda as células de cinco vezes 10 para a terceira células por microliter de buffer de carregamento de página SDS contendo concentração de SDS de 0,5% e Sonicate as amostras por 10 segundos em um Sonicator com uma amplitude de 10%. Em seguida, aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Para preparar lises para as vesículas extracelulares exósias enriquecidas, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em tampão de carregamento de página SDS contendo 0,5% SDS a 1,2 microgramas por concentração de microliter e Sonicate as amostras por 10 segundos, como demonstrado, então aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.
Para a Western Blot Analysis, carregue 10 extratos por atacado de microliter e amostras de liseto de vesícula extracelular enriquecido em wells individuais de um gel de página de estresse melhor. No final da corrida, transfira as proteínas para as membranas PVDF e incuba as membranas com os anticorpos primários e secundários apropriados de interesse, em seguida, detecte a expressão proteica usando um kit de detecção de chemiluminescência aprimorada, de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar a quantidade de GM-CSF dentro de vesículas extracelulares exóricas enriquecidas, use um kit Murine GM-CSF para revestir uma placa ELISA com anticorpo anti GM-CSF de captura em seguida, tratar 0,6 microgramas de amostras de vesículas extracelulares enriquecidas exósias com 100 microlitrais de PBS sozinho, ou PBS mais 0,05% interpolação 20 a temperatura ambiente por 30 minutos.
Ao final da incubação, adicione as amostras tratadas aos Poços individuais da placa ELISA preparada para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguida pela lavagem dos Poços correspondentes apropriados apenas com PBS, ou PBS mais 0,05% interpolação 20. Após a lavagem, adicione o anticorpo de detecção às amostras para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem apenas com PBS ou PBS mais 0,05% entre 20 como demonstrado, em seguida, adicione Avidin Horseradish Peroxidase às amostras para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem e medindo a absorção em cada poço em um Leitor de Microplata a 450 nações. A intensidade de fluorescência GFP de um GM-CSF expressando ESD três linhas celulares ou uma linha de três células ESD expressando um vetor vazio é muito maior do que a de seus colegas parentais.
ELISA revela que três células expressas GM-CSF produzem níveis notavelmente mais altos de GMCSF em sua cultura celular supernaduante do que células vazias de controle vetorial. Além disso, a quantidade de GM-CSF gerada pela GM-CSF expressando ESD três células é semelhante à produzida por fibroblastos STO que expressam GM-CSF. A microscopia eletrônica de transmissão de vesículas extracelulares isoladas de culturas celulares transduzidas por vetores e GM-CSF revelam vesículas de diferentes tamanhos que se enquadram na faixa esperada de 30 a 100 nanômetros de diâmetro.
A expressão de marcadores exosômicos, incluindo CD81, Anexo V e flotillina-1 é marcadamente aprimorada em vesículas extracelulares, isoladas de ESD três células em comparação com extratos de atacado correspondentes pela análise de manchas ocidentais. É importante ressaltar que não foi detectada a presença de outros marcadores de compartimento subcelular em ESD três vesículas extracelulares derivadas, incluindo o marcador de ânticulo endoplasmático, Isomerase de Dissulfeto proteico, os marcadores mitocondriais, o complexo citocromo C e Oxphos IV-subunit IV e o marcador citosolmático GAPDH. Após a lavagem com 0,05% de interpolação 20, os níveis gm-CSF de fundo detectados no controle Vesículas extracelulares foram significativamente reduzidos.
Em contraste, os níveis de GM-CSF nas vesículas extracelulares das células expressas GM-CSF foram significativamente aumentados por interpolação 20. Adquirir vesículas extracelulares supercelulares enriquecidas de alta qualidade carregando GMCSF é o passo mais importante para o sucesso deste protocolo. Os pesquisadores podem realizar experimentos adicionais, como estudos em linhas celulares e animais dependentes de GM-CSF para determinar se vesículas extracelulares enriquecidas que cuidam do GM-CSF podem funcionar como vesículas regulatórias imunológicas livres de células.
Essas vesículas extracelulares enriquecidas exósmos podem então ser usadas para explorar como a modulação da resposta imune afeta diferentes condições da doença.
