Наш протокол может быть использован для получения высококачественных экзосомных внеклеточных везикул из эмбриональных стволовых клеток, которые экспрессируют иммуностимулирующий фактор, GM-CSF. Экзосомы, обогащенные внеклеточными везикулами, несущие GM-CSF, могут служить бесклеточным иммунным регуляторным везикулам, которые могут модулировать иммунный ответ. Исследователи с базовой подготовкой в области молекулярной и клеточной биологии должны быть в состоянии легко, как и этот протокол, но любой, кто выполняет этот протокол впервые, должен внимательно следовать указаниям.
Поскольку наш протокол сложен, визуализация сложных деталей каждого шага поможет другим исследователям генерировать экзосомы без FBS, ультрацентрифугировать желаемый объем FBS и собирать экзосомный свободный супернатант. Перед покрытием ESD тремя клетками покрывать 15-сантиметровую ткани культуры посуды 0,1% желатина при комнатной температуре в течение 30 минут. Удаляют желатин путем аспирации и культивировали ESD три клетки без фидерного слоя клеток в ESD трехклеточной культурной среде при 37 градусах Цельсия в 5% Углекислотоки увлажненный инкубатор до тех пор, пока клетки не достигнут 90% конфюлюзии.
Промыть почти слие культуры пятью миллилитрами 0,05% трипсина на блюдо с последующей пятиминутной инкубацией при 37 градусах Цельсия в свежем трипсине. В конце инкубации вытягиваем отслоивающиеся клетки в центрифужную трубку и инактивируют трипсин пятью миллилитрами свежей питательной среды. Осаждение клеток путем центрифугирования и повторное суспендирование поддонов в свежей среде для подсчета Для пассажа плита пять раз 10 до шестой из трех клеток ESD в 15 миллилитрах клеточной культурной среды на новые пластины с желатиновым покрытием в течение трех дней посева перед субкультурированием клеток Собрать супернатант клеточной культуры для выделения экзосомы обогащенной внеклеточными везикулами пластинки один раз от 10 до седьмой ESD три клетки в 15 миллилитры клеточной культурной среды на новую пластину с желатиновым покрытием в течение трех дней до сбора супернатантов клеточной культуры Для экзосомы обогащенной внеклеточными среду выделения, сначала осадок крупных фрагментов клеток внутри супернатантов, собранных из 72-часового культивируемого ESD трех клеток путем центрифугирования.
После сбора супернатанта ультрацентрифугирует образцы и выбрасывает супернатанты. Осторожно промойте каждую паллетку два раза одним миллилитом PBS за стирку, чтобы удалить любой остаточный супернатант культуры и количественно оценить содержание белка экзосомы внеклеточных везикул с помощью анализа бицинхониновой кислоты, в соответствии с инструкцией производителя. Затем повторно приостанавливают экзосомы, обогащенные внеклеточными везикулами в PBS в концентрации шесть микрограммов на микрометр для хранения при минус 80 градусах Цельсия.
Для визуализации экзосомы, обогащенные внеклеточными везикулами, путем просвечивающей электронной микроскопии фиксируют от трех до пяти микрограммов на миллилитр внеклеточных везикул с конечной концентрацией 2%-ной сетки электронного микроскопа параформальдегида при комнатной температуре в течение двух часов. В конце инкубации загрузите 10 микролитров неподвижных образцов на медные сетки углеродной поддерживающей пленкой в течение одной минуты перед сливом сеток фильтровальной бумагой, оставайтесь в сетках с соответствующим раствором для окрашивания, согласно протоколу производителя, и используйте пинцет для переноса сеток на лист фильтровальной бумаги, затем используйте просвечивающенный электронный микроскоп с 50 000-кратным увеличением для получения изображений электронной микроскопии в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы подготовить экстракты цельных клеток, соберите ESD три клетки из культуры, как показано на демонстрации, и повторно приостановите собранные клетки в PBS для подсчета.
После второй центрифугирования повторно приостанавливайте ячейки из пяти раз от 10 до третьих клеток на микролитр буфера загрузки страницы SDS, содержащего 0,5% концентрации SDS, и соникуйте образцы в течение 10 секунд на Sonicator с амплитудой 10%. Затем нагревайте образцы при 100 градусах Цельсия в течение пяти минут. Чтобы приготовить лизаты для экзосом, обогащенных внеклеточными везикулами, повторно приостановите экзосомы, обогащенные внеклеточными везикулами, в буфере загрузки страниц SDS, содержащем 0,5% SDS при концентрации 1,2 микрограмма на микролитр, и соникуйте образцы в течение 10 секунд, как показано, а затем нагревайте образцы при 100 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Для анализа вестерн-блот загрузите 10 микролитровый оптовый экстракт и экзосомы, обогащенные внеклеточными образцами лизата везикул, в отдельные колодцы лучшего геля для стрессовой страницы. В конце пробега перенесите белки на мембраны PVDF и инкубируйте мембраны с соответствующими первичными и вторичными антителами, представляющими интерес, а затем обнаружите экспрессию белка с помощью улучшенного набора для обнаружения хемилюминесценции, в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы оценить количество GM-CSF в экзосомах, обогащенных внеклеточными везикулами, используйте набор Murine GM-CSF для покрытия ИФА-пластины антителом захвата против GM-CSF, затем обработайте 0,6 мкг экзосомных обогащенных внеклеточных везикул образцов 100 микролитрами только PBS или PBS плюс 0,05% анимации 20 при комнатной температуре в течение 30 минут.
В конце инкубации добавляют обработанные образцы в отдельные колодцы подготовленной ИФА-пластины в течение одного часа инкубации при комнатной температуре с последующей промывкой соответствующих скважин только PBS или PBS плюс 0,05% анимации 20. После промывки добавьте антитело к образцам для одночасовой инкубации при комнатной температуре с последующей промывкой только PBS или PBS плюс 0,05% анимации 20, как показано, затем добавьте пероксидазу авидина хрена в образцы для 30-минутной инкубации при комнатной температуре, а затем промывку и измерение поглощения в каждой скважине на считывателе microplate на 450 нанометрах. Интенсивность флуоресценции GFP GM-CSF, экспрессии экспрессии ESD трехклеточной линии или ESD трехклеточной линии, экспрессииющей пустой вектор, намного выше, чем у их родительских аналогов.
ИФА показывает, что три клетки ESD, экспрессивающие GM-CSF, производят заметно более высокие уровни GMCSF в их супернатанте клеточной культуры, чем пустые клетки контроля векторов. Кроме того, количество GM-CSF, генерируемого GM-CSF, экспрессирующих ESD три клетки, аналогично количеству, продуцируемому ФИБРОБЛАСТАМИ STO, экспрессирующими GM-CSF. Просвечивающая электронная микроскопия внеклеточных везикул, выделенных из векторно-трансдуцированных и трансдуцированных ГМ-CSF клеточных культур, выявляет везикулы разных размеров, которые попадают в ожидаемый диапазон диаметра от 30 до 100 нанометров.
Экспрессия экзосомальных маркеров, включая CD81, Annexin V и флотиллин-1, заметно усиливается во внеклеточных везикулах, выделенных из трех клеток ESD по сравнению с соответствующими оптовыми экстрактами методом анализа вестерн-блот. Важно отметить, что присутствие других субклеточных компартмент-маркеров в ESD трех производных внеклеточных везикул не было обнаружено, включая эндоплазматический маркер ретикулума, дисульфидную изомеразу белка, митохондриальные маркеры, цитохром C и комплекс Oxphos IV-субъединицу IV и цитозольный маркер GAPDH. После промывки 0,05%анимацией 20 фоновые уровни GM-CSF, обнаруженные в контрольных внеклеточных везикулах, значительно снижались.
Напротив, уровни GM-CSF во внеклеточных везикулах gm-CSF экспрессивных клеток были значительно увеличены на 20 твин. Приобретение высококачественных экзосом, обогащенных внеклеточными везикулами, несущих GMCSF, является наиболее важным шагом для успеха этого протокола. Исследователи могут провести дополнительные эксперименты, такие как исследования на ГМ-ликвор-зависимых клеточных линиях и животных, чтобы определить, могут ли экзосомы, обогащенные внеклеточными везикулами, ухаживающими за GM-CSF, функционировать как бесклеточные иммунные регуляторные везикулы.
Эти экзосомные обогащенные внеклеточные везикулы затем могут быть использованы для изучения того, как модуляция иммунного ответа влияет на различные состояния заболевания.
