مخك بفضل الهندسة في المملكة المتحدة، والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) واجهة برنامج علوم الحياة لزمالة الشخصية. ونود أيضا أن نعترف التمويل بواسطة التكنولوجيا الحيوية في المملكة المتحدة، والعلوم البيولوجية في مجلس البحوث (BBSRC).

وبروتوكولات لإعداد عينة فليم لا تختلف عن تلك التي للفحص المجهري كثافة مقرها مبائر أو واسعة في الميدان مضان. ويتبع في الحصول على البيانات من قبل المهمة الرئيسية لتحليل البيانات واستخراج أي عمر مضان من البيانات الخام. مرة واحدة وقد تم الحصول على هذه، وتفسير البيانات يساعد على التحقق من الفرضيات أو تزوير. 1. تلطيخ الخلايا مع الدوارات الجزيئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سهم (10 مل) من خلال حل ما يقرب من 1 ملغ / مل من الصبغة في مناسبة مذيب (الميثانول على سبيل المثال لBODIPY-C 12) 6،7 باستخدام ميزان دقيق وماصة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتزرع الخلايا (خلية سرطانية خط نموذج، هيلا في حالتنا) لتكون ملطخة على طبق من ذهب في multiwell مع السفلي coverslide للفحص المجهري، في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع أجواء 5٪ CO 2 حتى 80٪ ~ متكدسة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 - في الخلايا الحية التي تنمو في أهلا وسهلا متعددة 20 ميكرولتر من محلول المخزونلوحة ل (50 SmartSlide الدقيقة حضانة النظام، Wafergen) في 4 مل من غروب-MEM المتوسطة (GIBCO) لكل بئر لوحة 6 جيدا. هذه تعطي تركيز الصبغة الدقيقة الرحى في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة لوحة متعددة أيضا إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع أجواء 5٪ CO 2 ل10-45 دقيقة للتلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة multiwell من الحاضنة، ويغسل خلايا 3-4 مرات مع 4 مل واضح بصريا خلية ثقافة المتوسط ​​(على سبيل المثال غروب-MEM) لإزالة الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة multiwell إلى مرحلة مجهر والاتصال إلى وحدة تحكم في درجة الحرارة / 5٪ مدخل ثاني أكسيد الكربون غاز 2 كما هو مطلوب، وذلك استعدادا للتصوير. </li></ol> 2. فليم من الدوارات فلوري الجزيئية في الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العينة على مرحلة مجهر والحصول على نقل صورة ومضان لتحديد الخلايا فلوري. ويظهر رسم تخطيطي للالتجريبية مجموعة المتابعة في الشكل. 1.Verify أن ينبع من مضان بة المواقعالمديرية (مثل غشاء الخلية، والسيتوبلازم). الحصول على طيف الانبعاث مضان، والتحقق من ذلك هو أن من الصبغة أو بروتين المتوقع، في هذه الحالة طيف من الدوار الجزيئية. كوسيلة لمراقبة سلبية، صورة عينة غير ملون والتحقق من أنه لا يتألق. على الرغم من أن هذه الخطوة ليست ضرورية خصيصا للفليم، ومن الممارسات الجيدة بشكل عام ولا مساعدة للتحقق من أن النموذج هو ما كنت أعتقد أنه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع فليم - ويتم إنجاز هذا بسهولة عن طريق تحريك مرآة للخروج من مسار الكشف عن شعاع مضان (&quot;خارجي للكشف عن&quot; الموجود على لوحة &quot;مسار شعاع الإعداد&quot; على برنامج لايكا SP2 TCS سيطرة الاستحواذ). يجب على المرشح المناسب الانبعاثات مضان لمنع أي ضوء مثيرة من الوصول إلى الكشف عن أن تكون في beampath كشف مضان. </li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> الشكل 1. ترتيب التجريبي لمرة ونطاق فليم باستخدام تيار مترددالليزر onfocal المجهر. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح عينة والتحقق، على الكمبيوتر السيطرة على اكتساب فليم، أن معدل عدد كاشف (شريط أسود المسمى CFD على برنامج حاسوبي لمراقبة الاستحواذ على بيكر وHickl SPC 830 متن) هو لا يزيد عن 1٪ من معدل تكرار الليزر ( الشريط الأخضر المسمى SYNC برنامج حاسوبي لمراقبة الاستحواذ). إذا كان ذلك، والحد من شدة الإثارة الليزر، على سبيل المثال عن طريق وضع مرشح كثافة محايدا في مسار شعاع الليزر، لتجنب جمع كومة المتابعة مشوه منحنيات الاضمحلال مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة فليم، وعادة لمدة 3-5 دقيقة، والتوقف عن المسح الضوئي وحفظ البيانات الخام (أ 3D البيانات &quot;مكعب&quot; التي تتألف من x و y الإحداثيات المكانية، والوقت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البيانات الخام في حزمة الاضمحلال مضان برامج التحليل، على سبيل المثال TRI-2 14 أو البرمجيات التجارية، لعرض الصورة كثافة مضان. هذا هو ببساطة الاضمحلال متكاملة مضان، أي المنطقة الواقعة تحت منحنى الاضمحلال مضان، في كلبكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد بكسل نموذجي عن طريق وضع المؤشر على ذلك، وافحص الاضمحلال مضان في أن بكسل. إذا كان عدد الذروة هو أقل من 100، استخدم binning المكاني للخلية. تضاف تهمة المتاخمة بكسل (على سبيل المثال 3X3 أو 5x5) في بكسل المركزية، بحيث يتم الحصول على عدد أعلى قمة هناك. هذا يوفر دقة أعلى الإحصائية لاتخاذ الخطوة التالية. بدلا من ذلك، يمكن تكرار قياس لفترة أطول اكتساب (الخطوة 5). ل50min-30، يتم الحصول على حصيلة ما يقرب من 10 أضعاف الذروة (وتعول الكل)، ولكن هذا هو وقتا طويلا جدا لحظة الاستحواذ على معظم العينات البيولوجية بسبب الخطر من ادخال القطع الأثرية بسبب حركة العينة، والانجراف المجهر، والضيائية photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عتبة بكسل العالمية القيمة (أعلاه والتي يتم تركيبها في الاضمحلال في بكسل) وتطبيق واحد يصلح الاضمحلال الأسي على الصورة. نتيجة غلة العمر مضان لكل بكسل فوق العتبة، والتي يتم ترميز ثم فياللون. هو لون كل بكسل مع نتيجة لائقا، ويتم الحصول على خريطة فليم. تحقق من انخفاض تشي مربع القيم لمختلف بكسل - حوالي 1 (وتصل إلى 1.3) يدل على حسن صالح. فحص مخلفات المقابلة، والتي ينبغي أن توزع عشوائيا حول الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرسم البياني عمر مضان المؤامرات وكم عمر مضان معينة تحدث مقابل عمر مضان نفسها. ضبط نطاق اللون مثل أن توزيع عمر مضان يلائم نطاق اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا نوبة monoexponential لا تسفر عن قيمة خي مربع من حوالي 1 (وتصل إلى 1.3)، وهناك الانحراف المنهجي للمخلفات من الصفر، وهناك حاجة إلى نموذج أكثر تطورا. على سبيل المثال، حاول تركيب نموذج مزدوج الأسي ليضمحل مضان، على حساب لاثنين من بيئات مختلفة في التحقيق قد يكون فيها ومناسبا سيحقق أيضا عوامل ما قبل الأسي أو سعة والتي تعطي مؤشرا على مبلغ قريب من صبغة واحدة البيئيةمنة أو من جهة أخرى. بدلا من ذلك، قد امتدت وظيفة الأسي تكون ملائمة لرصد عملية توزيع عمر مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بعد ذلك نتائج لأعمار مضان، وعوامل ما قبل الأسي، ونسبة العمر، ونسبة عامل قبل الأسي لكل بكسل يتم تشفيرها في اللون. كل بكسل غير ملون وفقا لقيمتها، ويتم الحصول على النقيض من ذلك بسبب عمر مضان، وعوامل ما قبل الأسي والنسب. مرة أخرى، والتحقق من انخفاض تشي مربع القيم (التي يمكن أيضا أن يتم تشفيرها في اللون ويظهر على شكل صورة) - حوالي 1 (وتصل إلى 1.3) يدل على حسن صالح. فحص مخلفات، والتي ينبغي أن توزع عشوائيا حول الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن المدرج الاحصائي عمر مضان مرافقة جميع الصور للمن السهل تصور متوسط ​​القيم عمر مضان، وتوزيع عمر مضان. </li></ol> 3. ممثل النتائج يضمحل مضان قياس للوتظهر الدوار فلوري الجزيئية إلى زيادة اللزوجة في الميثانول / الجلسرين مخاليط في الشكل. 2. ويضمحل مضان هي monoexponential، وعمر مضان يختلف بشكل ملحوظ بوصفها وظيفة من اللزوجة. لأنه يزيد من حوالي 300 فرع فلسطين في الميثانول (اللزوجة 0.6 CP) إلى 3.4 نانوثانية في الجلسرين 95٪ (950 اللزوجة CP). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> الشكل 2. ملامح الاضمحلال الإسفار عن BODIPY-C 12 في الميثانول / الجلسرين خليط من اللزوجة متفاوتة. 6 المؤامرة معايرة لوغاريتمي من عمر مضان τ مقابل يظهر اللزوجة η لدوار الجزيئية فلوري في الشكل. 3. هذا هو خط مستقيم كما طالب المعادلة هوفمان فورستر 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> حيث ك 0 هو radiativ<html> معدل ثابت ه، و z و x هي ثوابت، مع 0 &lt;س &lt;1. أخذ اللوغاريتم على غلة الجانبين على حد سواء <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> حيث x هو التدرج في خط مستقيم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> الشكل 3. قطعة من اللزوجة سجل عمر مضان سجل للمباراة BODIPY-C غلة 12 خط مستقيم وفقا لمعادلة فورستر، هوفمان. 6 بعد حضانة الخلايا الحية مع الدوار الجزيئية فلوري لوحظ توزيع صبغ منقط في الصور مضان. وتظهر الصور فليم من خلايا هيلا حضنت مع صبغة BODIPY المتوسط ​​واستبداله في الشكل. 4. ويمكن أن يضمحل مضان في كل بكسل من الصورة مجهزة بشكل كاف باستخدام نموذج واحد الاضمحلال الأسي. &gt; <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig4.jpg" /> الشكل 4 (أ) شدة الإسفار والصور فليم (ب) من خلايا هيلا ملطخة BODIPY-C 12. ومشرق، والمناطق نقط يحمل أقصر مدى الحياة من مناطق أخرى. هذا أقصر liftime يتوافق مع انخفاض اللزوجة في نقاط و، قطرات الدهن على الأرجح، وفقا للمعادلة فورستر، هوفمان. بواسطة المتهم بالتآمر في أعمار المستخرجة من كل بكسل، نحصل على الرسم البياني عمر مضان من الصورة بأكملها كما هو مبين في الشكل. 5. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> الشكل 5. المدرج الإحصائي من عمر مضان من الصور فليم من خلايا هيلا ملطخة المتوسط ​​واستبدال الدوارات الجزيئية BODIPY.

<ol>
	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

فليم يقدم بعض المزايا الرئيسية على مدى شدة القائم على التصوير مضان. يمكن أن يقدم تقريرا عن أحداث photophysical أن من الصعب أو المستحيل لمراقبة من قبل التصوير كثافة مضان، لأنه لا يمكن فصلها عن التأثيرات تركيز fluorophore. هذا مفيد جدا لرسم خرائط لزوجة داخل الخلايا بواسطة الدوارات التصوير الجزيئي فلوري. ويمكن بسهولة عمر مضان أن تتحول إلى اللزوجة باستخدام الرسم البياني معايرة، كما هو مبين في الشكل. 3، ومستقلة عن تركيز الدوارات الجزيئية فلوري. في فليم قد تكون هناك القطع الأثرية التي يمكن أن تعقد تفسير البيانات. 10 التحف الآلي وتشمل الضوء المتناثرة والتي ستظهر باعتبارها ذروة على رأس بداية الاضمحلال مضان، ويجوز الخلط بينه وبين زمن الاضمحلال قصير، أو ذروة صغيرة بعد الحرية الدينية الدولية والتي قد تكون ناجمة عن انعكاسات داخل المجهر. يمكن التعرف على هذه التحف الضوء المتناثرة على هذا النحولأنه لا يمكن تمييزها مع التمييز الطيفية - هم دائما على نفس الموجة مثل ضوء مثيرة. نتذكر أن في الهواء، وعلى ضوء يسافر 30 سم في 1 النانوسيكند تساعد على تحديد الأصل من الأفكار. ويمكن تصفية أو مضان زجاج تسبب أيضا قطعة أثرية، لا سيما في مضان عينة منخفض، ولكن يمكن بسهولة تحديد هذا عن طريق أخذ عينة من دون قياس: إذا تم الحصول على الاضمحلال في ظل هذه الظروف، فإن ذلك يرجع إلى وثيقة وليس له اي علاقة مع عينة! من ناحية أخرى، نلاحظ أن تألق ذاتي عينة يمكن أن تسهم أيضا إلى الاضمحلال مضان. في الوقت مترابطة العد فوتون واحد (TCSPC)، الوقت للوصول الى سعة المحول (TAC) يجوز لغير linearities يسبب نوبات الفقراء، ولكن يمكن تحديدها من خلال منع الإثارة وتسليط الضوء، على سبيل المثال المحيطة من مصدر الضوء ينتقل على العينة وقياس توقيت. وينبغي أن تكون خلفية ثابتةتم الحصول عليها في كل بكسل من الصورة. والمناطق التي يكون فيها الانحراف عن خلفية ثابت يحدث، وتستسلم أبدا مناسبا، وينبغي تجنبها للقياس إذا لا يمكن القضاء عليها عن طريق ضبط المعلمات من أجل بطاقة TCSPC. واحد القطع الأثرية الشهيرة في TCSPC هو الفوتون كومة المتابعة والذي كان سببه أيضا ارتفاع معدل كشف الفوتون. 11،12 وهذا يؤدي إلى الفوتون الأول فقط يجري توقيتها، وتجاهل أي الفوتونات لاحقة، لأن الإلكترونيات هي توقيت مشغول وتجهيز الفوتون الأول. كومة المتابعة يؤدي الى تقصير عمر مضان، وأفضل طريقة لتجنب هذا هو الحفاظ على معدل العد فوتون في حوالي 1٪ من معدل تكرار ليزر. توقعات وهناك تطبيقات مختلفة من فليم، واعتمادا على التطبيق، كل له مزاياه وعيوبه. (13) مجهر مضان المثالي والحصول على كامل متعدد الأبعاد مضان emissioن من كفاف، شدة الموقف، والطول الموجي، مدى الحياة، والاستقطاب في قياس واحد، مع حساسية فوتون واحد، القرار المكانية القصوى والدنيا وقت الشراء. لا يوجد حاليا أي تكنولوجيا مع هذا مزيج فريد من السمات، وإلى بناء واحد لا يزال يشكل تحديا لمطوري الأجهزة. تطبيق تقنيات جديدة لمشاكل مادية هامة في بيولوجيا الخلية وغالبا ما يكون الطريق إلى اكتشافات غير متوقعة، وهناك طريق طويل يتعين قطعه قبل ونحن على مقربة من تشبع قدرات التصوير مضان لبيولوجيا الخلية. في الواقع، والتصوير المعلمات مضان مثل العمر، والطيف، والاستقطاب، فضلا عن التصوير بسرعة أكبر في 3D في أعلى المكاني القرار، من المؤكد أن تكشف عن جوانب جديدة في بيولوجيا الخلايا.

عينة مع الدوارات الجزيئية فلوري الأجهزة: المقلوب لايكا TCS مسح متحد البؤر المجهر SP2 متماسك ميرا 900 تي: ياقوت ليزر الفيمتو ثانية مع ليزر فيردي مضخة V6 أو هاماماتسو حزب العمال التقدمي-10 470 بيكو ثانية ليزر ديود مصادر الإثارة نابض بيكر وHickl SPC 830 في مجلس 3GHz، بنتيوم الرابع، 1GB RAM الكمبيوتر مع نظام التشغيل Windows XP تبريد بيكر ورئيس Hickl PMC100-01 كاشف على أساس photomultipliers هاماماتسو-01 H5773P، التي شنت على ميناء X1 المجهر، أو للكشف عن هجين DCC مراقبة للكشف عن 100 وحدة البرنامج: TRI-2 14 أو SPCImage 2.8 بواسطة بيكر وHickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

نشر في كثير من الأحيان مهمة تحديد معدل خطوة في التفاعلات الكيميائية أو العمليات البيولوجية، ويلعب دورا في طائفة واسعة من الأحداث داخل الخلية. اللزوجة هي واحدة من المعالم الرئيسية التي تؤثر على انتشار الجزيئات والبروتينات، وارتبطت التغيرات في اللزوجة للمرض وخلل على المستوى الخلوي. 1-3 في حين أن وسائل متطورة لقياس اللزوجة السائبة، والتصوير microviscosity لا يزال يشكل تحديا . خرائط من الكائنات المجهرية اللزوجة، مثل الخلايا واحدة، لديها حتى وقت قريب يصعب الحصول عليها. اللزوجة رسم الخرائط مع تقنيات مضان هو مفيد لأنه، على غرار التقنيات البصرية الأخرى، فمن مينيملي، غير مدمرة، ويمكن تطبيقها على الخلايا الحية والأنسجة. الدوارات الجزيئية فلوري يحمل عمر مضان والغلة الكم التي هي وظيفة من لزوجة المكروية بهم. التواء أو 4،5 ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئتناوب يؤدي إلى عدم الاضمحلال الإشعاعي من الخلف الحالة المثارة إلى الحالة الأرضية. إن وجود بيئة لزجة تبطئ هذا التناوب أو التواء، وتقييد الوصول إلى هذا المسار الاضمحلال غير الإشعاعي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الغلة الكم مضان وعمر مضان. مضان التصوير العمر (فليم) من تعديل الأصباغ BODIPY مسعور أن تكون بمثابة المحرك الجزيئي فلوري تبين أن عمر مضان من هذه التحقيقات هي وظيفة من microviscosity من بيئتهم. 6-8 مؤامرة لوغاريتمي من عمر مضان مقابل عوائد اللزوجة مذيب خط مستقيم أن يطيع المعادلة هوفمان فورستر. 9 هذه المؤامرة أيضا بمثابة معايرة الرسم البياني لتحويل حياة مضان في اللزوجة. بعد حضانة الخلايا الحية مع الدوار تعديل BODIPY الجزيئية فلوري، ويلاحظ توزيع صبغ منقط في الصور مضان. قيمة اللزوجة التي تم الحصول عليها في اله نقاط وفي الخلايا الحية هي في حدود 100 مرة أعلى من المياه ومن السيتوبلازم الخلوي. 6،7 الوقت لحلها القياسات تباين مضان تسفر مرات ارتباط التناوب في اتفاق مع هذه القيم microviscosity كبير. تعيين عمر مضان مستقلة عن كثافة مضان، ويسمح بالتالي فصل تركيز التحقيق والآثار اللزوجة. في ملخص، وضعنا نهجا عمليا وتنوعا لتعيين microviscosity في الخلايا استنادا فليم من الدوارات الجزيئية فلوري.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

وقد برزت مضان التصوير العمر (فليم) كأسلوب رئيسي لصورة البيئة وتفاعل بروتينات معينة، والأصباغ في الخلايا الحية. فليم من الدوارات الجزيئية فلوري يسمح رسم الخرائط من اللزوجة في الخلايا الحية.

مضان التصوير عمر الدوار الجزيئية في الخلايا الحية

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.7K Views.  King's College London. وقد برزت مضان التصوير العمر (فليم) كأسلوب رئيسي لصورة البيئة وتفاعل بروتينات معينة، والأصباغ في الخلايا الحية. فليم من الدوارات الجزيئية فلوري يسمح رسم الخرائط من اللزوجة في الخلايا الحية.

Video: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

بروتوكول حقن الدهون لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...