تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو في العامل الرئيسي في تطوير ندبا في كبيبات الكلى. باستخدام هذه الطريقة، يمكننا دراسة العمليات الخلوية المشاركة في هذا التنشيط ونأمل أن نجد خيارات العلاج لإبطاء أو حتى وقف تطور المرض. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أننا نستخدم الخلايا الأولية التي تنمو مباشرة من الكبيبات المعزولة.
بعد تحرير الكلى، كما هو موضح في المخطوطة النص، عقد الكلى مع ملقط الجراحية واستخدام زوج آخر من ملقط لسحب قبالة كبسولات الكلى. بعد ذلك، ضع الكلى في آبار لوحة ثقافة ستة بئر تحتوي كل منها على ملليلترين من HBSS ووضع لوحة الثقافة على الجليد. أولاً، نقل الكلى إلى طبق بيتري 100 ملليمتر واستخدام مشرطين لتلفرها إلى قطع صغيرة تكون حوالي ملليمترين.
الحفاظ على قطع الكلى المفروم الرطب مع HBSS. بعد ذلك، ضع قطع الكلى على رأس منخل معدني 300 ميكرومتر واضغط على الكلية من خلال المنخل باستخدام المكبس من حقنة 20 ملليلتر. شطف مرارا وتكرارا منخل مع HBSS في ما بين واستخدام ماصة المصلية لجمع تدفق من خلال ونقلها إلى طبق بيتري نظيفة.
استخدام مشرط لكشط قبالة كل ما تبقى في الجزء السفلي من الغربال ونقلها إلى تجانس الكلى التي تم جمعها. شطف تجانس الكلى من خلال منخل 75 و 53 ميكرومتر مع HBSS. ثم، غسل كل من الغربل مع HBSS لإزالة كل من الهياكل الصغيرة.
جمع هياكل الكلى والمواد التي بقيت في الغربال عن طريق غسل السطح العلوي من كل مع DMEM تكمل مع مصل عجل الجنين 20٪ ونقل المواد إلى آبار من ستة مرفقات منخفضة جداً microplate. جلب microplate مرفق منخفضة للغاية إلى مجهر ضوء مقلوب واستخدام ماصة 20 ميكروليت استغرق جمع واحد مغلفة وcroscapulated glomeruli. بعد اصطياد كبيبات واحدة في طرف ماصات، إضافة جديدة DMEM المتوسطة دون جمع مواد الكلى في نفس تلميح ماصة إلى حجم 20 ميكرولترات.
نقل الكبيبات واحد مع متوسطة DMEM إلى مركز بئر من 24 جيدا خلية لوحة الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات للسماح بتعلق من الكبيبات إلى مركز البئر. بعد الحضانة، سيتم إرفاق الكبيات إلى مركز البئر. إضافة بعناية 500 ميكرولتررس من وسط القاعية القاعدية تكملها مع مجموعة عامل النمو و5٪ إضافية FBS و 1٪ البنسلين وstreptomycin لكل بئر.
ثقافة [كبيبرولي] وحيدة في 37 درجات مئويّة مع 5٪ ثاني أكسيد كربون لستّة أيام. بعد ستة أيام من الحضانة، استخدم مجهرًا رقميًا مقلوبًا للضوء لالتقاط الصور وتحليل النمو الكببي. باستخدام برنامج تحليل الصور، حدد مساحة السطح من النمو الكبيائي عن طريق فتح أحد ملفات الصور مع شريط مقياس.
رسم خط مستقيم على شريط مقياس وانقر على تحليل، ثم قياس لتحديد المسافة بالبكسل. لتحديد المقياس، انقر فوق تحليل وتعيين مقياس وإدخال المسافة المعروفة بالبكسل، والمسافة المعروفة، ووحدة الطول. انقر على "حسناً" عند الانتهاء.
انقر على تحليل وتعيين القياسات. ثم، تحقق من الخيارات الخاصة بتسمية المنطقة والعرض. انقر على "حسناً" عند الانتهاء.
بعد ذلك ، رسم اختيار حر حول outgrowth الكبيات. انقر فوق تحليل وقياس لعرض جدول نتائج، والذي يحتوي على مساحة سطح النمو في المقياس المحدد سابقًا. في هذه الدراسة، يتم عزل الخلايا الظهارية الجدارية الكبيائية خارج الخلايا من glomeruli مغلفة من الكلى الماوس، مثقف، وتحليلها.
تظهر صور المجهر الضوئي التمثيلية النمو الكبيائي في نقاط زمنية مختلفة أثناء الثقافة بعد عزل الكبيّة عن كلى الماوس. من أجل التحقق من أن الخلايا التي تتفوق هي الخلايا الظهارية الجدارية ، يتم عزل الكبيبات المزيلة أيضًا وتنميتها لمدة ستة أيام. الكبيبات المُفكّرة تظهر لا تَنَمَّ خلية خلال فترة الحضانة هذه.
ثم يتم تنفيذ تلطيخ الفلورسنت لعلامات الخلايا الظهارية الجدارية المختلفة ، وعلامات موقع الصور الخاصة ، وكذلك علامات الخلايا البطانية. النتائج التحقق من صحة أن الخلايا التي تتفوق، في الواقع، هي الخلايا الظهارية الجدارية. Glomeruli المرتبطة من فئران خروج المغلوب CD44 تظهر انخفاضا في عدد الخلايا التي تتفوق، فضلا عن انخفاض مساحة السطح من خارج كبيبة مقارنة مع كبيبات معزولة عن الفئران من النوع البرية.
وهذا يشير إلى دور مهم لـ CD44 في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. باستخدام هذه التقنية، من الممكن أيضًا دراسة التأثيرات على الأدوية على تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. ويمكن القيام بذلك عن طريق علاج الكبيبات المعزولة مع الدواء الذي تختاره وتحليل الاختلافات في نمو الخلايا والهجرة الخلية.
