Активация теменной эпителиальной клетки является ключевым фактором в развитии рубцовой ткани в гломеруле почки. Используя этот метод, мы можем изучить клеточные процессы, участвующие в этой активации и, надеюсь, найти варианты лечения, чтобы замедлить или даже остановить прогрессирование болезни. Основным преимуществом нашей техники является то, что мы используем первичные клетки, которые растут прямо из изолированных glomeruli.
После освобождения почек, как указано в тексте рукописи, удерживайте почку хирургическими типсами и используйте еще пару типсов, чтобы снять почечные капсулы. После этого поместите почки в колодцы из шести хорошо культуры пластины, каждая из которых содержит два миллилитров HBSS и место культуры пластины на льду. Во-первых, перенесите почки в 100-миллиметровую чашку Петри и используйте два скальпеля, чтобы измельчить их на мелкие кусочки, которые примерно от одного до двух миллиметров.
Держите рубленые кусочки почек мокрыми с HBSS. Затем поместите кусочки почек поверх 300-метрового металлического сито и нажмите на почку через сито с помощью поршеня из шприца 20 миллилитров. Неоднократно промыть сито с HBSS между ними и использовать серологические пипетки для сбора потока через и передать его в чистую чашку Петри.
Используйте скальпель, чтобы соскребать все, что остается в нижней части сито и передать его в собранный гомогенат почек. Промыть гомогенат почек через сито 75 и 53 микрометров с помощью HBSS. Затем вымойте оба сито с HBSS, чтобы удалить все мелкие структуры.
Соберите структуры почек и материал, который остался в сито путем мытья верхней поверхности каждого с DMEM дополнен 20%fetal икроножной сыворотки и передачи материала в скважины из шести хорошо ультра-низкой микроплиги крепления. Принесите ультра-низкий микроплой крепления к перевернутому световому микроскопу и используйте 20 микролитровую пипетку, которая взяла одноместный инкапсулированный и /или decapsulated glomeruli. После ловли одного glomerulus в кончике пипетки, добавить свежие DMEM среды без собранного материала почек в тот же кончик пипетки в объеме 20 микролитров.
Передача одного glomerulus с DMEM среды в центр колодец 24 хорошо пластины культуры клеток и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение трех часов, чтобы вложение glomerulus в центре хорошо. После инкубации гломерул будет прикреплен к центру колодец. Аккуратно добавьте 500 микролитров эндотелиальной базальной среды, дополненную набором фактора роста и дополнительными 5%FBS и 1%пенициллином и стрептомицином к каждой хорошо.
Культура одного glomeruli при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа в течение шести дней. После шести дней инкубации используйте цифровой перевернутый световой микроскоп для получения изображений и анализа гломерулярного вырастания. Используя программное обеспечение для анализа изображений, определите площадь поверхности гломерулярного нарой, открыв один из файлов изображения с помощью планки масштаба.
Нарисуйте прямую линию на строке масштаба и нажмите на Analyze, а затем измерьте, чтобы определить расстояние в пикселях. Чтобы определить шкалу, нажмите Анализ и Установить шкалу и ввести известное расстояние в пикселях, известное расстояние и единицу длины. Нажмите Хорошо, когда закончите.
Нажмите на анализ и установить измерения. Затем проверьте параметры для Area и Display Label. Нажмите Хорошо, когда закончите.
Затем нарисуйте выбор от руки вокруг гломерулярного нарой. Нажмите Анализ и измерить, чтобы отобразить таблицу результатов, которая содержит площадь поверхности нарой в ранее определенных масштабах. в этом исследовании, гломерулярные теменные эпителиальные клеточные нарои инкапсулированные гломерули изолированы от почек мыши, культурны, и проанализированы.
Репрезентативные изображения световой микроскопии показывают гломерулярные нарои в разные моменты времени во время культуры после того, как гломерулы изолированы от почек мыши. Для того, чтобы подтвердить, что перерастает клетки теменных эпителиальных клеток, декапсулированные гломерули также изолированы и культурны в течение шести дней. Декапсулированные гломерули не показывают клеточного нароения в этот инкубационный период.
Иммунофторесцентное окрашивание затем выполняется для различных темальных эпителиальных маркеров клеток, фото сайт конкретных маркеров, а также эндотелиальных маркеров клеток. Результаты подтверждают, что перерастает клетки, действительно, теменые эпителиальные клетки. Гломерули, связанные с CD44 нокаут мышей показывают снижение числа перераставных клеток, а также снижение площади поверхности гломерулярного перераста по сравнению с glomeruli изолированы от диких мышей типа.
Это говорит о важной роли CD44 в активации теменной эпителиальной клетки. Используя этот метод, можно также изучить влияние на наркотики на теменной эпителиальной активации клеток. Это может быть сделано путем лечения изолированных glomeruli с препаратом по вашему выбору и проанализировать различия в росте клеток и миграции клеток.
