上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

頭頂頭細胞の活性化は、腎臓の糸球体における瘢痕組織の発達において重要な要因である。この方法を使用して、この活性化に関与する細胞プロセスを研究し、うまくいけば、病気の進行を遅くしたり止めたりする治療オプションを見つけることができます。私たちの技術の主な利点は、単離された糸球体からまっすぐに成長する一次細胞を使用することです。

腎臓を解放した後, テキスト原稿に記載されているように, 外科用鉗子で腎臓を保持し、腎カプセルを引き離すために鉗子の別のペアを使用します.この後、腎臓を6つの井戸培養プレートの井戸に入れ、それぞれに2ミリリットルのHBSSが含まれ、培養プレートを氷の上に置きます。まず、腎臓を100ミリメートルのペトリ皿に移し、2つのメスを使用して、約1〜2ミリメートルの小片にミンチします。

ひき肉の腎臓片をHBSSで濡らしてください。次に、腎臓片を300マイクロメートルの金属ふるいの上に置き、20ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用してふるいを通して腎臓を押します。HBSSを間に繰り返し洗浄し、血清ピペットを使用してフロースルーを収集し、きれいなペトリ皿に移します。

メスを使用してふるいの底に残っているすべてのものを削り取り、収集した腎臓ホモジネートに移します。HBSSで75と53マイクロメートルのふるいを通して腎臓ホモゲン酸をすすい。次に、HBSSで両方のふるいを洗浄し、小さな構造をすべて取り除きます。

20%の胎児の子牛の血清を補ったDMEMの各の上面を洗浄することによってふるいに残った腎臓構造および材料を集め、6つの極度低い取り付けマイクロプレートの井戸に材料を移す。超低い取り付けマイクロプレートを反転光顕微鏡に持ち込み、20マイクロリットルのピペットを使用して、単一のカプセル化および脱カプセル化された糸球体を収集します。ピペットチップに単一の糸球体をキャッチした後、20マイクロリットルの体積に同じピペットチップに腎臓材料を収集することなく、新鮮なDMEM培地を追加します。

DMEM培地を用いた単一の糸球体を24のウェル細胞培養板のウェルの中心に移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で3時間インキュベートし、糸球体を井戸の中心に付着させます。インキュベーション後、糸球体は井戸の中心に取り付けられます。慎重に成長因子キットと追加の5%FBSと1%ペニシリンとストレプトマイシンを補った内皮基底培地の500マイクロリットルを各ウェルに追加します。

5%の二酸化炭素を摂氏37度で6日間培養する。6日間のインキュベーションの後、デジタル反転光顕微鏡を使用して画像を撮影し、糸球体の成長を分析します。画像解析ソフトウェアを使用して、スケール バーを使用してイメージ ファイルの 1 つを開いて、糸球体伸成長の表面積を決定します。

スケール バーに直線を描き、[解析] をクリックし、測定して距離をピクセル単位で決定します。縮尺を決定するには、[解析とスケールの設定] をクリックし、既知の距離をピクセル単位で入力し、既知の距離と長さの単位を入力します。完了したら[問題ありません]をクリックします。

[測定の分析と設定]をクリックします。次に、[エリア] および [ラベルの表示] のオプションを確認します。完了したら[問題ありません]をクリックします。

次に、糸球体の成長の周りにフリーハンドの選択を描きます。[解析とメジャー] をクリックすると、以前に決定したスケールの伸びの表面積を含む結果テーブルが表示されます。本研究では、カプセル化糸球体上皮細胞の増殖は、マウス腎臓から分離され、培養され、分析される。

代表的な光顕微鏡画像は、糸球体がマウス腎臓から単離された後の培養中の異なる時点での糸球体の成長を示す。成長細胞が頭頂上皮細胞であることを検証するために、脱カプセル化糸球体は6日間も単離して培養される。脱カプセル化糸球体は、この潜伏期間中に細胞の成長を示さない。

免疫蛍光染色は、次いで異なる頭頂上皮細胞マーカー、写真部位特異的マーカー、ならびに内皮細胞マーカーに対して行われる。この結果は、成長細胞が実際に頭頂皮細胞であることを検証する。CD44ノックアウトマウスから関連する糸球体は、野生型マウスから単離された糸球体の成長の減少と同様に、成長細胞の減少数を示す。

これは、頭頂皮細胞活性化におけるCD44の重要な役割を示唆している。この技術を用いて,頭頂頭上皮細胞活性化に対する薬物への影響を研究することも可能である。これは、あなたの選択の薬物で単離糸球体リを治療し、細胞増殖と細胞移動の違いを分析することによって行うことができます.