הפעלה של תאי אפיתל קודקודית היא גורם מפתח בהתפתחות של רקמת צלקת בגלומרולוס של הכליה. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים ללמוד את התהליכים התאיים המעורבים בהפעלה זו ובתקווה למצוא אפשרויות טיפול כדי להאט או אפילו לעצור את התקדמות המחלה. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שאנו משתמשים בתאים ראשוניים הגדלים היישר מהגלומרולי המבודד.
לאחר לשחרר את הכליות, כפי שמתואר בכתב היד טקסט, להחזיק את הכליה עם מדפים כירורגיים ולהשתמש זוג אחר של מעצורים כדי למשוך את כמוסות הכליה. לאחר מכן, מניחים את הכליות לתוך בארות של צלחת תרבות שש היטב כי כל מכילים שני מיליליטר של HBSS ולה מניחים את צלחת התרבות על קרח. ראשית, להעביר את הכליות לצלחת פטרי 100 מילימטר ולהשתמש בשני אזמלים כדי לטחון אותם לחתיכות קטנות כי הם כאחד עד שני מילימטרים.
שמור את חתיכות הכליה טחון רטוב עם HBSS. לאחר מכן, מניחים את חתיכות הכליה על גבי מסננים מתכת 300 מיקרומטר ולחץ על הכליה דרך המזרק באמצעות הבוכנה ממזרק 20 מיליליטר. שטפו שוב ושוב את המסמר עם HBSS בין לבין ולהשתמש פיפטה סרולוגית כדי לאסוף את הזרימה דרך ולהעביר אותו לצלחת פטרי נקייה.
השתמש אזמל כדי לגרד את כל מה שנשאר בתחתית המסורה ולהעביר אותו הומוגניט הכליה שנאסף. לשטוף את הומוגנית הכליות דרך מסמרוז 75 ו 53 מיקרומטר עם HBSS. לאחר מכן, לשטוף את שני הסנובים עם HBSS כדי להסיר את כל המבנים הקטנים יותר.
לאסוף את מבני הכליות והחומר שנותרו בסובס על ידי שטיפת המשטח העליון של כל אחד עם DMEM בתוספת 20% סרום עגל עוברי ולהעביר את החומר ל הבאר של שישה מיקרופלסטיק מצורף אולטרה נמוך היטב. הביאו את המיקרופלאט עם ההחזקה האולטרה-נמוכה למיקרוסקופ אור הפוך והשתמשו בפיפטה של 20 מיקרוליטר שלקחה לאסוף אנקפסולציה אחת או גלומרולי ערוף. לאחר תפיסת גלומרולוס יחיד בקצה פיפטה, מוסיפים מדיום DMEM טרי ללא חומר כליות שנאסף לאותו קצה פיפטה לנפח של 20 מיקרוליטרים.
מעבירים את הגלומרולוס הבודד עם מדיום ה-DMEM למרכז באר של 24 צלחות תרבות תאים היטב ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שלוש שעות כדי לאפשר חיבור של הגלומרולוס למרכז הבאר. לאחר הדגירה, הגלומרולוס יצורף למרכז ה... הוסיפו בזהירות 500 מיקרוליטרים של מדיום בזל אנדותל בתוספת ערכת גורם גדילה ו-5%FBS נוספים ו-1%פניצילין וסטרפטומיצין לכל באר.
תרבות גלומרולי יחיד ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך שישה ימים. לאחר שישה ימים של דגירה, השתמש במיקרוסקופ אור הפוך דיגיטלי כדי לצלם תמונות ולנתח את ההתגלות. באמצעות תוכנה לניתוח תמונה, לקבוע את שטח הפנים של תפוגה גלומרולרית על ידי פתיחת אחד מקבצי התמונה עם סרגל קנה מידה.
צייר קו ישר על סרגל קנה המידה ולחץ על נתח ולאחר מכן למדוד כדי לקבוע את המרחק בפיקסלים. כדי לקבוע את קנה המידה, לחץ על נתח והגדר קנה מידה והקלט את המרחק הידוע בפיקסלים, המרחק הידוע ו יחידת האורך. לחץ על אישור כאשר תסיים.
לחץ על נתח והגדר מדידות. לאחר מכן, בדוק את האפשרויות עבור אזור ותווית תצוגה. לחץ על אישור כאשר תסיים.
לאחר מכן, צייר בחירה ביד חופשית סביב ההתגלות. לחץ על נתח ולמדוד כדי להציג טבלת תוצאות, המכילה את שטח הפנים של אורך חוץ בקנה המידה שנקבע קודם לכן. במחקר זה, תא אפיתל glomerular אפיתל נוצרים של glomeruli encapsulated מבודדים מכליות העכבר, מתורבת, ונותחו.
תמונות מיקרוסקופיות אור נציג להראות את ההתרחקויות גלומרולרי בנקודות זמן שונות במהלך התרבות לאחר glomerulus מבודדים מכליות העכבר. על מנת לאמת כי התאים מגודלים הם תאי אפיתל קודקודיים, גלומרולי ערוף הם גם מבודדים ותרבתיים במשך שישה ימים. גלומרולי ערוף לא מראה שום תנובה תא במהלך תקופת דגירה זו.
כתמים Immunofluorescent מבוצעת לאחר מכן עבור סמני תא אפיתל קוקודיים שונים, סמנים ספציפיים לאתר צילום, כמו גם סמני תא אנדותל. התוצאות מאמתות כי התאים הגדולים, אכן, הם תאי אפיתל קודקודיים. Glomeruli הקשורים עכברי נוקאאוט CD44 להראות מספר ירד של תאים צומחים, כמו גם שטח פנים ירד של צומח גלומרולרי לעומת glomeruli מבודד עכברים מסוג בר.
זה מרמז על תפקיד חשוב עבור CD44 בהפעלת תא אפיתל קודקודי. באמצעות טכניקה זו, ניתן גם ללמוד את ההשפעות על תרופות על הפעלת תא אפיתל קודקודית. זה יכול להיעשות על ידי טיפול glomeruli מבודד עם התרופה על פי בחירתך כדי לנתח את ההבדלים בצמיחת תאים הגירת תאים.
