La embriogénesis de C.elegans toma alrededor de 13 horas, y generalmente se monitorea filmando un embrión a la vez. Nuestro protocolo, sin embargo, permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D de 80 a 100 embriones. La capacidad de recopilar datos para un gran número de embriones C.elegans en desarrollo abre una nueva gama de experimentos, incluido el análisis cuantitativo de eventos de desarrollo y pantallas a gran escala.
Este protocolo se puede adaptar fácilmente para capturar diferentes procesos de desarrollo o para imaginar embriones que expresan cualquier combinación de marcadores en tejidos de interés. Es difícil dispersar adecuadamente los embriones dentro de los pozos. Deben estar cerca para permitir la captura de múltiples embriones por campo sin aglutinar en diferentes planos Z.
Recomendamos usar dos investigadores para la disección lado a lado, sobre hielo y bloquear los pozos no utilizados. También demostraremos algunos trucos útiles para configurar rápidamente una placa de 384 pozos bien escenificada. Comience sellando una placa de 384 bien con fondo de vidrio con lámina adhesiva PCR para enmascarar pozos no utilizados.
Usa una maquinilla de afeitar o bisturí para cortar la lámina y exponer un subconjunto de los pozos para su uso. Agregue 70 microlitros de TMHC recién preparado en cada pozo y mantenga la placa sobre hielo. Excluya las dos filas exteriores de la placa para evitar efectos de borde.
Para una rápida preparación de la muestra, se recomienda la disección en paralelo por dos investigadores. Cuando toda la solución haya sido chapada, utilice pinzas finas y un microscopio de disección para transferir alrededor de 10 adultos gravid a 150 microlitros de solución TMHC helada dentro de un portaobjetos de depresión por condición. Usando las pinzas y un bisturí, diseccione los gusanos para liberar los embriones y cargue una pipeta capilar tirada en un aspirador de boca.
Utilice la pipeta bucal para transferir todos los embriones de dos a ocho células en los pozos individuales de la placa preparada y examine la placa para confirmar que no hay agregados dentro de ningún pozo. Cuando se hayan recogido todos los embriones, asiente los especímenes por centrifugación y utilice una toallita empapada de etanol para eliminar cualquier residuo del fondo de la placa. Coloque la placa en el soporte de placa de un microscopio confocal equipado con un entorno de temperatura controlada y utilice el objetivo 10X para realizar un pre-escaneo de cada pozo para identificar campos con embriones adecuados.
Al final del escaneo, cambie al objetivo 60X, ajuste el plano focal en cada punto para crear una imagen de uno a cuatro campos por pozo y adquiera 18 secciones Z a intervalos de dos micrómetros cada 20 minutos durante 10 horas. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, realice una exploración de campo brillante baja y bien, aproximadamente de 20 a 24 horas después del inicio de la toma de imágenes durante la noche para evaluar la letalidad embrionaria. Para el recorte automatizado utilizando embryoCropUI ejecutable, primero descargue el programa de Zenodo y los archivos de prueba.
zip para determinar si el programa funciona correctamente en la plataforma. Una vez descargado, descomprima y navegue para encontrar el archivo ejecutable embryoCropUI y haga doble clic para iniciar el programa. Seleccione Abrir para cargar el primer campo de visión 4D específico para recortar.
Al recortar una serie TIFF con varias dimensiones, cargue solo la primera imagen de la serie dentro de la carpeta. Cuando se hayan cargado todas las imágenes, especifique los parámetros de imagen, seleccione la resta de fondo y la corrección de atenuación y establezca el orden de recopilación de imágenes y las micras por píxel. A continuación, seleccione ejecutar, se creará un nuevo recorte con etiqueta de subcarpeta en la misma ruta que la carpeta sin recortar y las versiones recortadas se guardarán en esta ubicación.
Para la visualización, descargue el plugin MSV2 ImageJ abierto y combinado e instrucciones de interfaz de usuario gráfica Zenodorepov2. docx de Zenodo y abrir el plugin en IMageJ. Localice las líneas tres y cuatro e introduzca la ubicación en la que se almacenarán las carpetas de imagen después del recorte.
Los nombres de carpeta de imagen de las condiciones que se van a procesar y el identificador alfanumérico único para cada experimento nocturno. Cuando se haya introducido toda la información, haga clic en Ejecutar. Aparecerá una ventana que iniciará un mensaje para navegar a la carpeta externa que contiene las carpetas de imágenes recortadas.
Una vez seleccionado aparecerá otra ventana que permitirá la especificación de los parámetros de imagen. Haga clic en Aceptar. El archivo compuesto comenzará a ensamblar.
Cuando se haya generado el compuesto, revise los archivos que se dejan abiertos. Cuando se capturan imágenes en conjunto cepas de reporteros personalizados proporcionan lecturas informativas para la mayoría de los eventos de desarrollo importantes. Incluyendo especificación de sulfato, intercalación dorsal, cerramiento epidérmico, elongación y neurogénesis.
24 horas después de la inyección es un punto de tiempo óptimo para la toma de imágenes. A partir de este momento, el agotamiento de las proteínas maternas y la inhibición de la expresión génica cigoótica son eficaces, produciendo fenotipos de firma distintos y altamente reproducibles en un amplio espectro de genes implicados en la especificación del sulfato y la morfogénesis. Es importante ser paciente durante los pasos de disección y selección de embriones.
Minimizar el aglomerado y seleccionar los planos focales adecuados también son esenciales para garantizar datos de alta calidad. Nuestro protocolo se puede realizar con una variedad de cepas de marcadores fluorescentes y en combinación con RNAi o mutantes. Nuestras herramientas de procesamiento permiten un análisis de datos simplificado, automatizado o manual.
Usando las cepas, métodos y herramientas descritas aquí nuestro grupo realizó una pantalla de alto contenido basada en ARNi dirigida a aproximadamente 2.000 genes necesarios para el desarrollo embrionario. Los métodos de rendimiento semi-alto eran esenciales para este proyecto.
