C.elegans 태아 발생에 대 한 소요 13 시간, 일반적으로 한 번에 하나의 태아를 촬영 하 여 모니터링. 그러나 우리의 프로토콜은 80-100개의 배아의 동시 3D 시간 경과 이미징을 허용합니다. 많은 수의 C.elegans 배아에 대한 데이터를 수집하는 기능은 발달 이벤트 및 대규모 스크린의 정량 적 분석을 포함하여 새로운 범위의 실험을 엽니다.
이 프로토콜은 다양한 발달 과정을 캡처하거나 관심 있는 조직에서 마커의 조합을 표현하는 배아를 이미지화하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 우물 내의 배아를 제대로 분산하는 것은 어렵습니다. 그(것)들은 다른 Z 비행기에 응집하지 않고 필드 당 다중 태아의 포착을 가능하게 하기 위하여 가까이 있어야 합니다.
두 명의 연구원을 나란히 해부, 얼음 에 사용하고 사용하지 않은 우물을 차단하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 신속하게 잘 준비 384 잘 플레이트를 설정하기위한 몇 가지 유용한 트릭을 보여줍니다. 먼저 사용하지 않은 우물을 가리기 위해 PCR 접착제 호일로 유리 바닥 384웰 플레이트를 밀봉합니다.
면도기 나 메스를 사용하여 호일을 잘라 내어 웰의 하위 집합을 노출하십시오. 갓 준비된 70마이크로리터를 각 우물에 넣고 접시를 얼음 위에 보관합니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 플레이트의 외부 두 행을 제외합니다.
신속한 샘플 준비를 위해 두 명의 연구원이 나란히 해부하는 것이 좋습니다. 모든 용액이 도금되면 미세 핀셋과 해부 현미경을 사용하여 약 10 명의 중력 성인을 조건당 한 우울증 슬라이드 내에서 얼음 차가운 TMHC 용액 150 마이크로 리터로 전송하십시오. 핀셋과 메스를 사용하여 벌레를 해부하여 배아를 방출하고 당겨지는 모세관 파이펫을 입 흡입기에 넣습니다.
구강 파이펫을 사용하여 2~8세포 단계 배아를 모두 준비된 플레이트의 개별 우물로 옮기고 플레이트를 검사하여 어떤 우물 내에 골재가 존재하지 않는지 확인한다. 모든 배아가 수집되면 원심분리에 의해 표본을 정산하고 에탄올에 담근 닦아 플레이트 바닥에서 잔류물을 제거합니다. 온도 조절 환경을 갖춘 공초점 현미경의 플레이트 홀더에 플레이트를 놓고 10X 목표를 사용하여 각 웰의 사전 스캔을 수행하여 적합한 배아를 가진 필드를 식별합니다.
스캔이 끝나면 60X 목표로 전환하여 각 지점에서 초점 평면을 조정하여 웰당 1~4개의 필드를 이미지화하고 10시간 동안 20분마다 2마이크로미터 간격으로 18개의 Z 단면을 획득합니다. 모든 이미지가 획득되면, 배아 치사성을 평가하기 위해 밤새 이미징이 시작된 후 약 20~24시간, 저음, 전체적으로 잘 밝은 필드 스캔을 수행합니다. 배아CropUI 실행 파일을 사용하여 자동화 된 자르기의 경우 먼저 제노도와 테스트 파일에서 프로그램을 다운로드하십시오.
지퍼는 프로그램이 플랫폼에서 제대로 작동하는지 여부를 결정합니다. 일단 다운로드, 압축을 풀고 탐색 배아CropUI 실행 파일을 찾아 프로그램을 시작 하려면 두 번 클릭. 열려 있는 선택을 선택하여 첫 번째 특정 4D 시야 필드를 자르기 위해 로드합니다.
여러 차원의 TIFF 시리즈를 자르면 폴더 내의 계열의 첫 번째 이미지만 로드됩니다. 모든 이미지가 로드되면 이미징 매개 변수를 지정하고 배경 감속 및 감쇠 보정을 선택하고 이미지 수집 순서와 픽셀당 미크론을 설정합니다. 그런 다음 실행을 선택하면 잘라낸 폴더와 동일한 경로에 새 하위 폴더 레이블이 표시된 자르기가 만들어지고 잘라낸 버전이 이 위치에 저장됩니다.
시각화를 위해 개방적이고 결합된 MSV2 ImageJ 플러그인 및 그래픽 사용자 인터페이스 지침 Zenodorepov2를 다운로드하십시오. 제노도에서 독과 IMageJ에서 플러그인을 엽니 다. 3줄과 4선을 찾고 자르기 후에 이미지 폴더가 저장되는 위치를 입력합니다.
처리할 조건의 이미지 폴더 이름과 각 야간 실험에 대한 고유한 유수 식별자입니다. 모든 정보를 입력한 경우 실행을 클릭합니다. 자른 이미지 폴더가 들어 있는 외부 폴더로 이동하라는 메시지가 나타납니다.
선택한 다른 창이 나타나면 이미징 매개 변수의 사양을 허용합니다. 확인을 클릭합니다. 복합 파일이 조립되기 시작합니다.
합성이 생성되면 열려 있는 파일을 검토합니다. 사용자 지정 리포터 균주와 함께 이미지화하면 대부분의 주요 발달 이벤트에 대한 유익한 판독을 제공합니다. 황산염 사양, 등변 간연, 표피 인클로저, 신장 및 신경 발생을 포함합니다.
주사 후 24 시간은 이미징을위한 최적의 시간 지점입니다. 이 때 모계 단백질 고갈 및 zygotic 유전자 발현의 억제는 황산염 사양 및 형태발생에 관여하는 광범위한 유전자 스펙트럼을 통해 뚜렷하고 재현 가능한 시그니처 표현형을 모두 효과적인 산출한다. 해부 및 배아 선택 단계 동안 인내심을 두는 것이 중요합니다.
응집기를 최소화하고 적절한 초점 평면을 선택하는 것도 고품질 데이터를 확보하는 데 필수적입니다. 우리의 프로토콜은 다양한 형광 마커 균주와 RNAi 또는 돌연변이체와 함께 수행 할 수 있습니다. 로크티어처리 툴은 간소화, 자동화 또는 수동 데이터 분석을 가능하게 합니다.
여기에 설명된 균주, 방법 및 도구를 사용하여 우리 그룹은 배아 발달에 필요한 약 2, 000 유전자를 대상으로 RNAi 기반의 고함량 스크린을 수행했습니다. 이 프로젝트에는 세미 하이 처리량 방법이 필수적이었습니다.
