C.elegans embryogenesis leva cerca de 13 horas, e geralmente é monitorado filmando um embrião de cada vez. Nosso protocolo, no entanto, permite a imagem simultânea de lapso de tempo 3D de 80 a 100 embriões. A capacidade de coletar dados para um grande número de embriões C.elegans em desenvolvimento abre uma nova gama de experimentos, incluindo análise quantitativa de eventos de desenvolvimento e telas de grande escala.
Este protocolo pode ser facilmente adaptado para capturar diferentes processos de desenvolvimento ou para embriões de imagem expressando qualquer combinação de marcadores em tecidos de interesse. É desafiador dispersar adequadamente os embriões dentro dos poços. Eles devem estar próximos para permitir a captura de múltiplos embriões por campo sem aglomerados em diferentes planos Z.
Recomendamos o uso de dois pesquisadores para dissecção lado a lado, no gelo e bloqueio de poços não usados. Também demonstraremos alguns truques úteis para configurar rapidamente uma placa de 384 poços bem encenada. Comece selando uma placa de 384 poços com papel alumínio adesivo PCR para mascarar poços nãousados.
Use uma navalha ou bisturi para cortar a folha para expor um subconjunto dos poços para uso. Adicione 70 microliters de TMHC recém-preparado em cada poço e mantenha a placa no gelo. Exclua as duas linhas externas da placa para evitar efeitos de borda.
Para uma rápida preparação da amostra, recomenda-se dissecção lado a lado por dois pesquisadores. Quando toda a solução tiver sido emplacada, use pinças finas e um microscópio de dissecção para transferir cerca de 10 adultos gravid em 150 microlitros de solução TMHC gelada dentro de um slide de depressão por condição. Usando a pinça e um bisturi, disseca os vermes para liberar os embriões e carregar uma pipeta capilar puxada em um aspirador bucal.
Use a pipeta bucal para transferir todos os embriões de estágio de duas a oito células em poços individuais da placa preparada e examinar a placa para confirmar que não há agregados presentes dentro de quaisquer poços. Quando todos os embriões forem coletados, assar as amostras por centrifugação e usar uma limpeza encharcada de etanol para remover qualquer resíduo da parte inferior da placa. Coloque a placa no suporte da placa de um microscópio confocal equipado com um ambiente controlado pela temperatura e use o objetivo de 10X para realizar uma pré-varredura de cada poço para identificar campos com embriões adequados.
No final da varredura, mude para o objetivo de 60X, ajuste o plano focal em cada ponto para imagem de um a quatro campos por poço e adquira 18 seções Z em dois intervalos de micrômetros a cada 20 minutos durante 10 horas. Quando todas as imagens foram adquiridas, realizem uma varredura de campo baixo, todo bem brilhante, aproximadamente 20 a 24 horas após o início da imagem durante a noite para avaliar a letalidade embrionária. Para o corte automatizado usando o executável embryoCropUI, primeiro baixe o programa do Zenodo e dos arquivos de teste.
zip para determinar se o programa está funcionando corretamente na plataforma. Uma vez baixado, descompacte e navegue para encontrar o arquivo executável embryoCropUI e clique duas vezes para iniciar o programa. Selecione aberto para carregar o primeiro campo 4D específico de exibição para cortar.
Ao cortar uma série TIFF com múltiplas dimensões, carregue apenas a primeira imagem da série dentro da pasta. Quando todas as imagens tiverem sido carregadas, especifique os parâmetros de imagem, selecione a subtração de fundo e a correção de atenuação e defina a ordem de coleta de imagens e os mícrons por pixel. Em seguida, selecione a execução, uma nova safra rotulada por subpato será criada no mesmo caminho que a pasta não cortada e as versões cortadas serão salvas neste local.
Para visualização, baixe o plugin MSV2 ImageJ aberto e combinado e instruções de interface de usuário gráfico Zenodorepov2. docx de Zenodo e abra o plugin no IMageJ. Localize as linhas três e quatro e insira o local em que as pastas de imagem serão armazenadas após o corte.
Os nomes das pastas de imagem das condições a serem processadas e o identificador alfanumérico único para cada experimento noturno. Quando todas as informações foram inseridas, clique em executar. Uma janela será exibida que iniciará um prompt para navegar até a pasta externa contendo as pastas de imagem cortadas.
Uma vez selecionada, aparecerá outra janela que permitirá a especificação dos parâmetros de imagem. Clique bem. O arquivo composto começará a ser montado.
Quando o composto for gerado, revise os arquivos que são deixados abertos. Quando imagens em conjunto, as cepas personalizadas dos repórteres fornecem leituras informativas para a maioria dos principais eventos de desenvolvimento. Incluindo especificação de sulfato, intercalação dorsal, invólucro epidérmico, alongamento e neurogênese.
24 horas após a injeção é um ponto de tempo ideal para a imagem. A partir deste momento, o esgotamento da proteína materna e a inibição da expressão genética zigótica são ambos eficazes produzindo fenótipos de assinatura distintos e altamente reprodutíveis em um amplo espectro de genes envolvidos na especificação de sulfato e morfogênese. É importante ser paciente durante as etapas de dissecção e seleção de embriões.
Minimizar a aglomeração e selecionar os planos focais apropriados também são essenciais para garantir dados de alta qualidade. Nosso protocolo pode ser realizado com uma variedade de cepas de marcadores fluorescentes e em combinação com RNAi ou mutantes. Nossas ferramentas de processamento permitem análise simplificada, automatizada ou manual de dados.
Usando as cepas, métodos e ferramentas descritas aqui, nosso grupo realizou uma tela de alto conteúdo baseada em RNAi visando aproximadamente 2.000 genes necessários para o desenvolvimento embrionário. Métodos de rendimento semi-alto foram essenciais para este projeto.
