نهجنا يسمح لنا بإجراء التحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس fumigatus كونيديا في كامل جبل تطهيرها بصريا الرئة الماوس. أسبرجريلوس fumigatus كونيديا يمكن أن تخترق الجهاز التنفسي وتسبب أمراضا تهدد الحياة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. الجهاز التنفسي من الثدييات هو نظام من الشعب الهوائية من أجيال مختلفة.
يتميز كل جيل بهياكل مختلفة من جدران مجرى الهواء وخلايا المناعة. في الفروع القصبية، يتم القضاء على أسبرجريلوس فوميديا عن طريق إزالة المخصبات. ومع ذلك ، في المساحة المتاحة ، لا يعمل إزالة المخ والخلايا المناعية ، مثل الضامة السنخية والنيتروفيل.
كما هو الجوانب الزمنية المكانية لتوزيع كونيديا في الشعب الهوائية مهمة. ومع ذلك ، لم يتم التحقيق بشكل صحيح السؤال في فهم آليات المرض. هنا نقدم الإعداد التجريبي للتحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية للفئران المصابة.
أنا تطبيق 50 ميكرولتر من المسمى Aspergillus fumigatus كونيديا إلى الماوس. بعد ست ساعات، حصاد الرئة. إصلاح بين عشية وضحاها في 2٪ الفورمالديهايد ووصمة عار مع ستريبتافيدين المسمى اقتران.
ثم تخضع العينة للمقاصة البصرية. ضع العينة في الزجاجة المليئة بمحلول مياه الميثانول بنسبة 50٪ وضعه على خلاط العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. استبدال 50٪ الميثانول مع الميثانول 100٪ووضعه تحت خلاط عينة لمدة ساعتين.
إعداد خليط يتكون من جزء واحد البنزيل الكحول، وجزئين من البنزيل بنزوات. نقل العينة إليها 24 لوحة جيدا وتغطيتها بخليط البنزيل بنزوات لمدة 30 دقيقة على الأقل. العينة جاهزة للتصوير.
وضع العينة على حامل العينة. ووضع حامل في المجهر. بعد تشغيل نظام المجهر وفتح البرنامج، قم بتشغيل ضوء الإرسال وحدد هدفا X.
حدد موقع العينة في ضوء الإرسال بصريا ثم انتقل إلى علامة التبويب الاستحواذ. حدد وضع المجهر الليزر confocal لامبدا. قم بتشغيل الليزر المناسب.
تعيين النطاق الطيفي للكشف وتحديد المرآة ديكهرويك. ضبط كسب كاشف وتضييق الثقب لوحدة منطقة واحدة. تعيين دقة بكسل إلى 512 بواسطة 512.
قم بتشغيل وضع zed-stack وابدأ التصوير المباشر. العثور على المستوى البؤري حيث كل من الزهر مرئية. قم بتوسيع لوحة zed-stack.
باستخدام عجلة التركيز، ابحث عن أدنى وأعلى مستويات العينة وحددها. ضع المستوى البؤري بجوار الجزء السفلي من العينة. قم بإيقاف تشغيل وضع zed-stack ثم قم بتشغيل وضع المسح الضوئي بالطلب.
إذا لزم الأمر، ضبط X، Y الموقف وعدد البلاط. تشغيل أوضاع zed-stack والمسح الهاتفي. تعيين zed-المقطع خطوة إلى خمسة ميكرون.
تعيين سرعة المسح الضوئي. ابدأ التجربة. يستغرق التصوير عادة عدة ساعات اعتمادا على حجم الأرض وسرعة المسح الضوئي.
ثم يتم الحصول على الصورة بشكل طيفي. ل unmixing الطيفية، استخدم الخيار unmixing الخطية. حدد المناطق المقابلة للمناطق البرية المسماة بالستريبتافيدين والكونيديا.
ابدأ في الزم. بعد إلغاء التكفير عن حفظ الملف غير المهول. إلى البلاط stich من الصورة التي تم الحصول عليها، افتح الصورة.
حدد الطرق، خياطة هندسية. حدد الصورة في إطار الإدخال. في خيارات خياطة، حدد الإخراج الجديد وصمامات البلاط الخيار.
استخدم الوضع المرجعي مع قناة محددة تتوافق مع مضان مجرى الهواء. افتح الصورة في عرض ثلاثي الأبعاد فائض. إذا لزم الأمر، تغيير الألوان المستخدمة لعرضهم التقديمي.
هنا نعرض قناة الخطوط الجوية في ظلال رمادية وقناة كونيديا باللون الأرجواني. لإنشاء قناع مجرى الهواء، استخدم إضافة أداة سطح جديدة. حدد قناة مجرى الهواء واختر معلمة التنعيم من 10 ميكرون.
يمكن استخدام مرشحات مختلفة لاستبعاد من إشارة مجرى الهواء. أولا، فحص بصريا السطح وتعيين عتبة كثافة. يمكن أيضا تطبيق مرشحات إضافية ، مثل مساحة السطح على مجواة بحرية محددة حصريا ، ولكن ليس الجنبية أو الأوعية الدموية.
بعد ذلك، حذف جزء السطح المحدد الذي لا ينتمي إلى الشعب الهوائية يدويا. الآن يمكنك مراقبة السطح الذي تم إنشاؤه والتحقيق في الأجزاء المفقودة لتصحيحها لاحقا. إنشاء قناع لسطح مجرى الهواء باستخدام خيارات تحرير وإخفاء كل شيء.
حدد قناة مجرى الهواء وتعيين خلايا العمل خارج السطح إلى 0.001. هنا أظهرنا القناع الناتج باللون البرتقالي. حفظ قناة كونيديا وقناع مجرى الهواء في مجلدين منفصلين، كما T من سلسلة F.
افتح الملف مع صورة قناع مجرى الهواء. جعل الصورة ثنائية. اتبع عملية ثنائية، وجعل ثنائي.
لتشبه سمك القناع، وتطبيق العديد من وظائف 3D توسيع. اتبع الإضافات، وعملية، توسيع 3D. يمكنك أيضا استخدام وظائف وحدات الماكرو للقيام بذلك.
بعد عدة دورات من عملية توسيع، استخدم وظيفة ثقوب التعبئة. متابعة العملية، ثنائي، ملء الثقوب. لملء الثقوب المتبقية في القناع يدويا، افتح منطقة مدير الفائدة.
اتبع تحليل، وأدوات، مدير عائد الاستثمار. باستخدام أداة تحديد المضلع حدد منطقة يجب ملؤها في إسقاط معين واحد. القيام بذلك عدة مرات لعدد قليل من التوقعات في zed-كومة بحيث يمكنك الاستيفاء الأشكال من المناطق ذات الاهتمام.
لاستكمال الأشكال المحددة، حدد كل الأشكال واضغط على المزيد، قم باستكمال ROIs. ثم ملء جميع ROIs مع الأبيض. استخدم إجراء فتحات التعبئة مرة أخرى.
لإعادة تجميع سمك القناع مرة أخرى بعد ملء الثقوب، وتطبيق وظيفة 3D تآكل. اتبع الإضافات، وعملية، تآكل 3D. يمكنك أيضا استخدام ميكرو لهذا الغرض.
يجب أن يكون عدد التكرارات في تآكل 3D و LA 3D متساويا. تشغيل تطبيق العد كونيديا. اضغط على زر إضافة ملفات وحدد المجلدات مع ملفات DIFF مع قناع مجرى الهواء المعد وصور Conidia الفلورية.
تعيين عتبة مخصصة بين صفر وواحد. اضغط موافق و اطلع على النتائج. باستخدام هذا النهج، ونحن إجراء التحليل الكمي للConidia داخل وخارج شجرة الشعب الهوائية من الفئران بعد ست ساعات من تطبيق كونيديا.
تشير البيانات إلى أنه عند تطبيقنا الأصلي ، تخترق غالبية كونيديا مساحة الحويصلة المخصصة هناك في بداية الاستجابة المناعية الالتهابية. التصوير ثلاثي الأبعاد لرئتي الفأر مع المجهر المسح بالليزر confocal يسمح تحديد أسبرجريلوس fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية. معالجة الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام هذا البروتوكول يسمح بإجراء تحليل كمي لتوزيع كونيديا داخل وخارج فروع الشعب الهوائية.
ويمكن أيضا استخدام نهجنا لتقدير حركية القضاء كونيديا من بعيدا من الفئران ومقارنة توزيع كونيديا التشريحية في الفئران المناقصة المناعية والمناعة. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء تحليل توزيع الجسيمات الدقيقة أو جزيئات النانو التي تتكتل في الشعب الهوائية.
