وقد مكّن هذا البروتوكول من تطوير نماذج لسرطان الرأس والرقبة مع عملية جينومية محددة، مما أثر بشكل كبير على فهمنا لدور الطفرات الجينية المحددة في عملية الأورام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السهولة التي يمكن تطوير خط الخلية من أي جهاز تقريبا. إثبات الإجراء سيكون مانو براساد طالب غراد من مختبري.
تبدأ باستخدام مقص الجراحية لحصاد اللسان من ستة أسابيع من العمر الذكور أو الإناث B6 الفأر المعدلة وراثيا. استخدام مشرط ل mince الأنسجة إلى شظايا صغيرة جدا وجمع القطع في أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على 4.5 ملليلتر من 111000000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 إضافة 200 ميكرولترات من مزيج انزيم الثلاثي إلى أنبوب واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة التنصت على الأنبوب كل 10 دقائق لتعزيز تفكك الأنزيمية من الأنسجة.
في نهاية الحضانة، ووقف التفاعل مع 5٪ FBS في برنامج تلفزيوني وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة شبكة متر 70 ميكرو لفصل الخلايا من شظايا الأنسجة أكبر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم قم بلوحة الخلايا في ثلاثة ملليلترات من المتوسط الكامل لكل طبق 16 ملليمتر.
نقل مجاميع الخلية الاحتفاظ بها على رأس المرشح إلى طبق ثقافة منفصلة 16 ملليمتر وإضافة ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. حافظ على كل من الأطباق في الحاضنة حتى تتشكل مستعمرات الخلايا المتميزة. بعد أسبوع واحد من الثقافة، فحص مجهري الثقافات الخلية الأولية لوجود التلوث الليفي، وعلاج الخلايا مع 25٪ التربسين في EDTA 02٪في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، وإزالة أي الخلايا الليفية.
في اليوم 10 من الثقافة استخدام 25٪ التربسين في 02٪ EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية لحصاد الخلايا من خلية تعليق أو الخلايا الثقافات الكلية ونرى مرتين 10 إلى الخلايا الأولية الخامسة في مليلترين المتوسطة في بئر في كل بئر من لوحة 6-جيدا. في اليوم التالي تحويل الخلايا مع مرة واحدة 10 إلى 12 الجينوم الفيروسي لكل ملليلتر واحتضان الخلايا في المتوسطة المحتوية على الجسيمات الفيروسية لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استبدال عظمى الثقافة مع مليلتر اثنين من المتوسطة كاملة جديدة في البئر وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.
بعد أسبوعين من التوسع في الثقافة، بذور الخلايا للتحقق من صحة وفي التجارب ورمويجيني في الجسم الحي. باستخدام AAV CAS9 ناقلات، مرة واحدة 10 إلى 12 الجينوم الفيروسي لكل ملليلتر من الفيروس وقد تم تحديد لتحويل بكفاءة خلايا الميث الأولية إلى خرائط الأورام باستخدام البروتوكول كما هو موضح. الخلايا العابرة اكسبرس كري، CAS9 وبروتين الفلورسنت الأخضر.
حقن خمس مرات 10 إلى الخرائط AAV الأولية الخامسة التي تم تحويلها إلى اللسان والشفة والجلد من الفئران NOD SCID ، يؤدي إلى تكوين الورم في هذه الحيوانات على عكس حقن الخرائط الأولية ، والتي لا تحفز الأورام. يمكن تأكيد التحول الأورام من الخلايا الظهارية الرئيسية اللسان باستخدام immunofluorescence وغرب النشاف. يؤكد التحليل الجينومي عن طريق التسلسل العميق للحمض النووي ، المعزول عن الخلايا المتحولة ، تحرير الجينات الفعالة وshiftshift من بروتين الورم 53 والجينات APC من قبل نظام AAV CAS9.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا اللسان المحولة تشكل بشكل فعال الأورام في النوع البري C57 الأسود ستة الفئران. يكشف التحليل المناعي الرثولوجي للخلايا السرطانية النائية عن التعبير السيتوبلازمي لـ E-Cadherin و Keratin 14 ، وكلاهما علامات الأنسجة الظهارية. عند محاولة هذا الإجراء، تذكر دائما أن الكثير من الالغام أو الكثير من التفاعل الأنزيمي يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة معاملة الفيروس.
باستخدام هذا الإجراء، يمكن تعديل خطوط الخلايا وراثيا للحصول على نظرة ثاقبة إمكانات الأورام والنابث للخلايا السرطانية من أي نسيج الفائدة.
