Этот протокол позволил разработать модели рака головы и шеи с помощью специфической геномной операции, что существенно повлияло на наше понимание роли специфических генных мутаций в процессе неоплазии. Основным преимуществом этой техники является легкость, с которой клеточная линия может быть разработана практически из любого органа. Демонстрация процедуры будет Ману Прасад аспирант из моей лаборатории.
Начните с использования хирургических ножниц, чтобы собрать язык из шестинедельного мужчины или женщины B6 трансгенной мыши. Используйте скальпель, чтобы измельчить ткани на очень мелкие фрагменты и собрать кусочки в 15 миллилитровую трубку, содержащую 4,5 миллилитров обычной среды RPMI без сыворотки. Добавьте 200 микролитров тройной ферментной смеси в трубку и инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, постукивая по трубке каждые 10 минут, чтобы усилить ферментативную диссоциацию ткани.
В конце инкубации, остановить реакцию с 5%FBS в PBS и фильтровать подвеску клетки через 70 микрометровый ситечко сетки, чтобы отделить клетки от больших фрагментов ткани. Соберите клетки путем центрифугации и повторно приостановить гранулы в три миллилитров полной среды. Затем пластины клетки в три миллилитров полной среды на 16 миллиметров блюдо.
Передача клеточных агрегатов, сохраненных поверх фильтра, в отдельное 16-миллиметровое культурное блюдо и добавление трех миллилитров полной среды. Храните оба блюда в инкубаторе до тех пор, пока не будут сформированы различные колонии клеток. После одной недели культуры, микроскопически изучить первичные клеточные культуры на наличие загрязнения фибробластов, лечение клеток с 25%трипсина в 02%EDTA при 37 градусов по Цельсию в течение одной минуты, и удалить любые фибробласты.
На 10-й день культуры использовать 25%трипсина в 02%EDTA в течение трех-пяти минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы собрать клетки из клеточной суспензии или клеточной совокупности культур и увидеть два раза от 10 до пятой первичных клеток в двух миллилитров среднего на колодец в каждом хорошо 6-хорошо пластины. На следующий день трансдуцировать клетки с 1 раз от 10 до 12 вирусного генома на миллилитр и инкубировать клетки в вирусной частицы, содержащие среды в течение 48 часов при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации замените супернатанты культуры двумя миллилитров свежей полной среды на колодец и верните клетки в инкубатор клеточной культуры.
После двух недель расширения культуры, семена клеток для проверки и in vivo опухолевых экспериментов. Используя вектор AAV CAS9, один раз от 10 до 12 вирусных геномов на миллилитр вируса были определены для эффективного преобразования первичных клеток метамфетамина в опухолевые карты с помощью протокола, как показано. Трансинированные клетки Express Cre, CAS9 и зеленый флуоресцентный белок.
Инъекция от пяти раз от 10 до пятого первичного AAV трансдуцированных карт в язык, губы и кожу мышей NOD SCID, приводит к образованию опухоли у этих животных в отличие от инъекций первичных карт, которые не вызывают опухолей. Опухолевая трансформация первичных эпителиальных клеток языка может быть подтверждена с помощью иммунофторесценции и западного blotting. Геномный анализ путем глубокого секвенирования ДНК, изолированной от трансформированных клеток, подтверждает эффективное редактирование генов и кадровое смещение опухолевых белков 53 и APC генов системой AAV CAS9.
Кроме того, преобразованные клетки языка эффективно образуют опухоли в диких типаХ C57 черных шести мышей. Иммуногистохимический анализ неопластических опухолевых клеток выявляет цитоплазмическую экспрессию E-кадерин и кератин 14, оба эпителиальных маркеров тканей. При попытке этой процедуры, всегда помните, что слишком много mincing или слишком много энзиматической реакции привести к снижению жизнеспособности клеток, что приводит к снижению эффективности транзакций вируса.
Используя эту процедуру, клеточные линии могут быть генетически модифицированы, чтобы получить представление о опухолевых и метастатических потенциал раковых клеток из любой ткани, представляющие интерес.
