Este protocolo possibilitou o desenvolvimento de modelos de câncer de cabeça e pescoço com operação genômica específica, impactando significativamente nossa compreensão do papel de mutações genéticas específicas no processo de neoplasia. A principal vantagem dessa técnica é a facilidade com que a linha celular pode ser desenvolvida a partir de praticamente qualquer órgão. Demonstrando o procedimento será Manu Prasad uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Comece usando uma tesoura cirúrgica para colher a língua de um rato transgênico B6 masculino ou feminino de seis semanas de idade. Use um bisturi para cortar o tecido em fragmentos muito pequenos e coletar os pedaços em um tubo de 15 mililitros contendo 4,5 mililitros de meio liso RPMI sem soro. Adicione 200 microliters de mistura de enzima tripla ao tubo e incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos tocando o tubo a cada 10 minutos para melhorar a dissociação enzimática do tecido.
No final da incubação, pare a reação com 5% de FBS no PBS e filtre a suspensão celular através de um coador de malha de 70 mímetros para separar as células dos fragmentos de tecido maiores. Colete as células por centrifugação e suspenda a pelota em três mililitros de meio completo. Em seguida, aplaque as células em três mililitros de meio completo por prato de 16 milímetros.
Transfira os agregados celulares retidos em cima do filtro para um prato de cultura separado de 16 milímetros e adicione três mililitros de meio completo. Mantenha os dois pratos na incubadora até formar colônias de células distintas. Após uma semana de cultura, examine microscopicamente as culturas celulares primárias para a presença de contaminação do fibroblasto, tratando as células com 25% de trippsina em 02%EDTA a 37 graus Celsius por um minuto, e remova quaisquer fibroblastos.
No dia 10 de cultura use 25% de trippsina em 02%EDTA por três a cinco minutos a 37 graus Celsius para colher as células da suspensão celular ou culturas agregadas de células e ver duas vezes 10 a quinta células primárias em dois mililitros de médio por poço em cada poço da placa de 6 poços. No dia seguinte transduem as células com uma vezes 10 a 12 genomas virais por mililitro e incubam as células no meio de partícula viral por 48 horas a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, substitua os supernacantes culturais por dois mililitros de meio completo fresco por poço e devolva as células à incubadora de cultura celular.
Após duas semanas de expansão da cultura, semeou as células para validação e experimentos tumorigênicos in vivo. Usando o vetor AAV CAS9, uma vez 10 a 12 genomas virais por mililitro de vírus foram determinados a transformar eficientemente células primárias de metanfetamina em mapas tumorigênicos usando o protocolo como demonstrado. As células transduzidas Express Cre, CAS9 e Green Fluorescent Protein.
A injeção de cinco vezes 10 para o quinto AAV primário transduziu mapas na língua, lábio e pele de camundongos NOD SCID, resulta na formação de tumores nesses animais ao contrário da injeção de mapas primários, que não induzem tumores. A transformação tumorigênica das células epiteliais primárias da língua pode ser confirmada usando imunofluorescência e mancha ocidental. A análise genômica por sequenciamento profundo do DNA, isolado das células transformadas, confirma a edição efetiva de genes e mudança de quadro dos genes da proteína tumoral 53 e APC pelo sistema AAV CAS9.
Além disso, as células da língua transformadas formam tumores eficientemente em seis camundongos pretos tipo C57. A análise imunohistoquímica das células tumorais neoplásicas revela expressão citoplasmática de E-Cadherin e Queratina 14, ambos marcadores de tecido epitelial. Ao tentar este procedimento, lembre-se sempre que muito picar ou reação enzimática demais leva à redução da viabilidade das células, levando à redução da eficiência das transações de vírus.
Usando este procedimento, as linhas celulares podem ser geneticamente modificadas para obter uma visão sobre o potencial tumorigênico e metastático das células cancerosas de qualquer tecido de interesse.
