Dieses Protokoll ermöglichte die Entwicklung von Kopf- und Halskrebsmodellen mit spezifischer genomischer Operation, was unser Verständnis der Rolle spezifischer Genmutationen im Prozess der Neoplasie erheblich beeinflusste. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Leichtigkeit, mit der die Zelllinie aus praktisch jedem Organ entwickelt werden kann. Demonstrieren das Verfahren wird Manu Prasad ein Grad Student aus meinem Labor sein.
Beginnen Sie mit einer chirurgischen Schere, um die Zunge von einer sechs Wochen alten männlichen oder weiblichen B6-Transgenmaus zu ernten. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in sehr kleine Fragmente zu zerkleinern und die Stücke in ein 15-Milliliter-Rohr mit 4,5 Milliliter n.R. RUM ohne Serum zu sammeln. Fügen Sie 200 Mikroliter dreifachen Enzymmix in die Röhre und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten tippen Sie auf die Röhre alle 10 Minuten, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.
Beenden Sie am Ende der Inkubation die Reaktion mit 5%FBS in PBS und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikrometer Maschensieb, um die Zellen von den größeren Gewebefragmenten zu trennen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in drei Millilitern des gesamten Mediums wieder auf. Dann die Zellen in drei Milliliter komplettes Medium pro 16 Millimeter Schale auffüllen.
Übertragen Sie Zellaggregate, die auf dem Filter zurückgehalten werden, auf eine separate 16-Millimeter-Kulturschale und fügen Sie drei Milliliter komplettes Medium hinzu. Halten Sie beide Gerichte im Brutkasten, bis sich verschiedene Zellkolonien bilden. Nach einer Woche Kultur, mikroskopisch untersuchen die primären Zellkulturen auf das Vorhandensein von Fibroblasten Kontamination, Behandlung der Zellen mit 25%Trypsin in 02%EDTA bei 37 Grad Celsius für eine Minute, und entfernen Sie alle Fibroblasten.
Am Tag 10 der Kultur verwenden Sie 25%Trypsin in 02%EDTA für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen aus der Zellsuspension oder Zellaggregatkulturen zu ernten und zwei mal 10 bis fünf primäre Zellen in zwei Millilitern Medium pro Brunnen in jeden Brunnen der 6-Well-Platte zu sehen. Am nächsten Tag transducieren sie die Zellen mit einem Mal 10 zum 12 viralen Genom pro Milliliter und inkubieren die Zellen im viralen partikelhaltigen Medium für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Kulturüberstandmittel durch zwei Milliliter frisches komplettes Medium pro Brunnen ersetzen und die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Nach zwei Wochen Kulturerweiterung, Samen die Zellen für die Validierung und in vivo tumorigenic Experimente. Mit Dem AAV CAS9-Vektor wurden ein mal 10 bis die 12 viralen Genome pro Milliliter Virus bestimmt, um primäre Meth-Zellen mithilfe des protokolls effizient in tumorgene Karten umzuwandeln. Die transduzierten Zellen Express Cre, CAS9 und Green Fluorescent Protein.
Die Injektion von fünf mal 10 in die fünfte primäre AAV-transduzierte Karten in die Zunge, Lippe und Haut von NOD SCID Mäusen, führt zu Tumorbildung bei diesen Tieren im Gegensatz zur Injektion von primärkarten, die keine Tumoren induzieren. Die tumorgene Transformation von primären Zungenepithelzellen kann durch Immunfluoreszenz und Western-Blotting bestätigt werden. Die Genomanalyse durch tiefe Sequenzierung der DNA, die aus den transformierten Zellen isoliert wird, bestätigt die effektive Genbearbeitung und Frameverschiebung der Tumorproteine 53 und APC-Gene durch das AAV CAS9-System.
Darüber hinaus bilden die transformierten Zungenzellen effizient Tumore in wilden Typ C57 schwarz sechs Mäuse. Die immunhistochemische Analyse der neoplastischen Tumorzellen zeigt die zytoplasmatische Expression von E-Cadherin und Keratin 14, beides Epithelgewebemarker. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens immer daran, dass zu viel Hacken oder zu viel enzymatische Reaktion zu einer verminderten Lebensfähigkeit der Zellen führen, was zu einer verringerten Effizienz der Virustransaktion führt.
Mit diesem Verfahren können die Zelllinien genetisch verändert werden, um Einblicke in das tumorgene und metastasierende Potenzial von Krebszellen aus jedem Gewebe von Interesse zu gewinnen.
