In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Ce protocole a permis le développement de modèles de cancer de la tête et du cou avec un fonctionnement génomique spécifique, ce qui a un impact significatif sur notre compréhension du rôle de mutations génétiques spécifiques dans le processus de la néoplasie. Le principal avantage de cette technique est la facilité avec laquelle la lignée cellulaire peut être développée à partir de pratiquement n’importe quel organe. Manu Prasad, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure.

Commencez par utiliser des ciseaux chirurgicaux pour récolter la langue à partir d’une souris transgénique B6 mâle ou femelle de six semaines. Utilisez un scalpel pour hacher le tissu en très petits fragments et recueillir les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant 4,5 millilitres de milieu uni RPMI sans sérum. Ajouter 200 microlitres de mélange triple enzyme au tube et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en tapant sur le tube toutes les 10 minutes pour améliorer la dissociation enzymatique du tissu.

À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec 5%FBS dans PBS et filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire en maille de 70 micromètres pour séparer les cellules des fragments de tissus plus grands. Recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en trois millilitres de milieu complet. Ensuite, plaquez les cellules en trois millilitres de milieu complet par plat de 16 millimètres.

Transférer les agrégats cellulaires conservés sur le dessus du filtre dans un plat de culture séparé de 16 millimètres et ajouter trois millilitres de milieu complet. Gardez les deux plats dans l’incubateur jusqu’à formation de colonies cellulaires distinctes. Après une semaine de culture, examiner au microscope les cultures cellulaires primaires pour la présence de contamination par le fibroblaste, le traitement des cellules avec 25% trypsine dans 02%EDTA à 37 degrés Celsius pendant une minute, et enlever les fibroblastes.

Le jour 10 de la culture utiliser 25% trypsine dans 02%EDTA pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius pour récolter les cellules de la suspension cellulaire ou des cultures globales cellulaires et voir deux fois 10 à la cinquième cellules primaires en deux millilitres de milieu par puits dans chaque puits de la plaque de 6 puits. Le lendemain, transduire les cellules avec une fois 10 à 12 génome viral par millilitre et incuber les cellules dans le milieu contenant des particules virales pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, remplacer les supernatants de culture par deux millilitres de milieu complet frais par puits et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire.

Après deux semaines d’expansion de la culture, ensemencer les cellules pour validation et des expériences tumoriogènes in vivo. À l’aide du vecteur AAV CAS9, on a déterminé qu’une fois 10 à 12 génomes viraux par millilitre de virus transformaient efficacement les cellules primaires de méthèque en cartes tumoriogènes en utilisant le protocole tel que démontré. Les cellules transduced Express Cre, CAS9 et Green Fluorescent Protein.

Injection de cinq fois 10 à la cinquième primaire AAV transduced cartes dans la langue, la lèvre et la peau des souris SCID NOD, entraîne la formation de tumeurs chez ces animaux contrairement à l’injection de cartes primaires, qui n’induisent pas de tumeurs. La transformation tumorigénique des cellules épithéliales primaires de langue peut être confirmée utilisant l’immunofluorescence et le ballonnement occidental. L’analyse génomique par séquençage profond de l’ADN, isolé des cellules transformées, confirme l’édition et le changement de cadre efficaces des gènes de protéine tumorale 53 et APC par le système AAV CAS9.

En outre, les cellules de langue transformées forment efficacement des tumeurs dans le type sauvage C57 noir six souris. L’analyse immunohistochimique des cellules tumorales néoplastiques révèle l’expression cytoplasmique d’E-Cadherin et de kératine 14, deux marqueurs épithéliales de tissu. Lorsque vous essayez cette procédure, rappelez-vous toujours que trop de hachage ou trop de réaction enzymatique conduire à une viabilité réduite des cellules, conduisant à une réduction de l’efficacité des transactions virales.

En utilisant cette procédure, les lignées cellulaires peuvent être génétiquement modifiées pour avoir un aperçu du potentiel tumoriogène et métastatique des cellules cancéreuses à partir de n’importe quel tissu d’intérêt.