פרוטוקול זה איפשר התפתחות של מודלים של סרטן הראש והצוואר עם פעולה גנומית ספציפית, והשפיע באופן משמעותי על הבנתנו את תפקידן של מוטציות גנים ספציפיות בתהליך הניאופלזיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן לפתח את קו התא כמעט מכל איבר. הדגמת ההליך תהיה מאנו פראסאד סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
התחל על ידי שימוש במספריים כירורגיים כדי לקצור את הלשון מעכבר מהומר זכר או נקבה בן שישה שבועות B6. השתמש אזמל כדי לטחון את הרקמה לתוך שברים קטנים מאוד ולאסוף את החלקים לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 4.5 מיליליטר של מדיום רגיל RPMI ללא סרום. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים משולשת לצינור ודגירים את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הקשה על הצינור כל 10 דקות כדי לשפר את הדיסוציאציה האנזימטית של הרקמה.
בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 5%FBS ב PBS ולסנן את השעיית התא דרך מסננת רשת 70 מיקרו מטר כדי להפריד את התאים מן שברי הרקמה הגדולים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בשלושה מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן צלחת התאים בשלושה מיליליטר של מדיום מלא לכל צלחת 16 מילימטר.
העבר צבירות תאים שנשמרו על גבי המסנן לצלחת תרבות נפרדת של 16 מילימטרים והוסף שלושה מיליליטר של מדיום שלם. שמור את שתי הכלים באינקובטור עד שנוצרות מושבות תאים נפרדות. לאחר שבוע של תרבות, מיקרוסקופית לבחון את תרבות התאים העיקרית לנוכחות של זיהום fibroblast, טיפול בתאים עם 25% טריפסין ב 02% EDTA ב 37 מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולהסיר את כל fibroblasts.
ביום 10 של תרבות להשתמש 25% טריפסין ב 02%EDTA במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקצור את התאים מן התבלינים מתלים התא או תאים צבירה ולראות פעמיים 10 לתאים העיקריים החמישי בשני מיליליטר של בינוני לתוך כל באר של צלחת 6 באר. למחרת להתמר את התאים עם אחד פעמים 10 כדי 12 הגנום ויראלי למיליליטר ולהדגיר את התאים במדיום המכיל חלקיקים ויראלי במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף האינקובציה, החלף את על-טבעי התרבות בשני מיליליטר של מדיום שלם טרי ל הבאר והחזר את התאים לחממת תרבות התאים.
לאחר שבועיים של התרחבות תרבותית, זרע את התאים לאימות וניסויים vivo tumorigenic. באמצעות וקטור AAV CAS9, פעם אחת 10 כדי 12 גנומים ויראליים למיליליטר של וירוס נקבעו ביעילות להפוך תאי ספיד ראשוניים למפות tumorigenic באמצעות הפרוטוקול כפי שהודגם. התאים המתווצרים אקספרס קר, CAS9 וחלבון פלואורסצנטי ירוק.
הזרקה של חמש פעמים 10 למפות AAV העיקרי החמישי מתמר לתוך הלשון, השפה והעור של עכברי NOD SCID, תוצאות היווצרות הגידול בבעלי חיים אלה בניגוד להזרקה של מפות ראשוניות, אשר אינם גורמים גידולים. הטרנספורמציה tumorigenic של תאים אפיתל הלשון העיקרית ניתן לאשר באמצעות immunofluorescence ו כתמים מערביים. ניתוח גנומי על ידי רצף עמוק של דנ"א, מבודד מהתאים שהשתנו, מאשר את עריכת הגנים היעילה ואת המסגרת של החלבון הגידולי 53 וגנים APC על ידי מערכת AAV CAS9.
בנוסף, תאי הלשון שהשתנו יוצרים ביעילות גידולים בסוג הבר C57 שחור שישה עכברים. ניתוח אימונוהיסטוכימי של תאי הגידול הניאופלסטיים חושף ביטוי ציטופלסמי של E-Cadherin ו Keratin 14, שני סמני רקמת אפיתל. כאשר מנסים הליך זה, תמיד לזכור כי יותר מדי בשר טחון או תגובה אנזימטית יותר מדי להוביל הכדאיות מופחתת של התאים, המוביל יעילות עסקה וירוס מופחתת.
באמצעות הליך זה, קווי התא ניתן לשנות גנטית כדי לקבל תובנה לתוך פוטנציאל tumorigenic ו גרורתי של תאים סרטניים מכל רקמה מעניינת.
