تلعب التغيرات الميتوكوندريا أدواراً هامة في سرطانات المبيض البشرية. هذا البروتوكول إنشاء منصة فعالة لعزل وتنقية الميتوكوندريا من سرطان المبيض البشري والأنسجة السيطرة على تحليل البروتيوميكس على نطاق واسع. الميتوكوندريا, كمراكز استقلاب الطاقة, إشارات الخلية, والأكسدة, نظرة ثاقبة التغيرات في بروتيوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض تستفيد لدينا آلية الفهم الجزيئي, وهو اكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة والأهداف العلاجية.
تستخدم هذه التقنية الطرد المركزي للسرعة التفاضلية بالاقتران مع الطرد المركزي للتدرجات الكثافة لفصل الميتوكوندريا عن سرطان المبيض البشري في الأنسجة المتحكمة، مما يؤدي إلى عينات الميتوكوندريا عالية الجودة للتحليل الكمي للبروتيوميات. وقد تم بنجاح إعداد الميتوكوندريا, إلى جانب البروتيوم الكمي iTRAQ, استخدمت بنجاح في تحليل أنسجة سرطان المبيض البشري, الذي يترجم بسهولة لتحليل الأنسجة الأخرى, الميتوكوندريا البروتيوميات. أولئك الذين لم يسبق لهم أن أداء هذه الطريقة قد تجد أنه يمكن أن يكون من الصعب عزل الميتوكوندريا من السيطرة على المبيض من أنسجة السرطان.
من الضروري إضافة التربسين لتحسين تجانس الأنسجة المتحكم بها وإضافة طبقة إضافية من متوسطة تدرج الكثافة لتحسين فصل الميتوكوندريا. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد 250 ملليلتر من المخزن المؤقت المعزول الميتوكوندريا كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع ما يقرب من 1.5 غرام من أنسجة سرطان المبيض في طبق زجاجي نظيف.
أضف مليلترين من عازل العزل الميتوكوندريا قبل التبريد لغسل الدم بخفة من سطح الأنسجة. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. ثم، استخدم مقصًا نظيفًا للمعالجة العينية لشق الأنسجة بالكامل إلى قطع تكون حوالي ملليمتر مكعب واحد، ونقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر.
إضافة 13.5 ملليلتر من العازلة العازلة الميتوكوندريا التي تحتوي على ناغارسي بتركيز 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر. استخدم التجانس الإلكتروني لتجانس الأنسجة المفرومة لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. بعد هذا، إضافة ثلاثة ملليلتر آخر من العازلة العازلة عزل الميتوكوندريا إلى تجانس الأنسجة ومزجها جيدا عن طريق الأنابيب.
جهاز طرد مركزي متجانس الأنسجة المعدة في 1، 300 XG، وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بيليه والحفاظ على supernatant. بعد ذلك، الطرد المركزي الماخطِع في 10،000 xg وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
إزالة عظمى التي تحتوي على ميكروسوم، والحفاظ على بيليه. إضافة 2 ملليلتر من العازلة العازلة العزل الميتوكوندريا وإعادة تعليق بيليه بدقة عن طريق الأنابيب الخفيفة. الطرد المركزي هذا تعليق بيليه في 7، 000 XG وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل supernatant ، والحفاظ على بيليه ، الذي يحتوي على الميتوكوندريا الخام. إضافة 12 ملليلتر من 25٪ متوسطة الانحدار الكثافة لإعادة تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة. جعل تدرج كثافة متقطعة تحتوي على الميتوكوندريا الخام التي أعيد تعليقها كما هو مبين في بروتوكول النص، والطرد المركزي في 52، 000 xg، وعلى أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة.
استخدام حقنة طويلة وحاد لجمع الميتوكوندريا المنقى في واجهة بين 25٪ و 30٪ وسائط التدرج، ونقل هذا إلى أنبوب نظيف. أضف عازل العزلة الميتوكوندرية إلى الميتوكوندريا التي تم جمعها لتخفيفه إلى وحدة تخزين ثلاثية. جهاز طرد مركزي في 15، 00 xg، وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
تجاهل المناط، والحفاظ على بيليه. جمع بيليه النهائي الذي يحتوي على الميتوكوندريا المنقى، وتخزينها في 20 درجة مئوية. أولاً، إعداد 250 ملليلتر من العازلة العازلة عزل الميتوكوندريا كما هو موضح في بروتوكول النص.
إضافة ما يقرب من 1.5 غرام من أنسجة المبيض التحكم الطبيعي إلى طبق زجاجي نظيف. أضف مليلترين من عازل العزل الميتوكوندريا قبل التبريد لغسل الدم بخفة من سطح الأنسجة. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات.
باستخدام مقص العيون النظيفة، وشق كامل الأنسجة إلى قطع التي هي ما يقرب من 1 ملليمتر مكعب، ونقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب 50 ملليلتر نظيفة. إضافة ثمانية ملليلتر من محلول يحتوي على 0.05٪ التربسين و 20 ملليمولار EDTA وPSS إلى أنسجة التحكم المفروم، وهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للمساعدة في زلاح الخلايا وإطلاق الميتوكوندريا. جهاز طرد مركزي على 200 xg لمدة خمس دقائق.
تجاهل المُنَتَكَر، والحفاظ على الأنسجة والخلايا. إضافة 13.5 ملليلتر من العازلة العازلة عزل الميتوكوندريا التي تحتوي على ناغارسي بتركيز 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر، واستخدام التجانس الكهربائية لتجانس الأنسجة المفرومة في أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. إضافة ثلاثة ملليلتر آخر من العازلة العزل الميتوكوندريا إلى تجانس الأنسجة وخلطها جيدا عن طريق الأنابيب.
جهاز طرد مركزي متجانس الأنسجة المعدة في 1، 300 xg وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة بيليه والحفاظ على supernatant. جهاز طرد مركزي في 10،000 xg وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
إزالة عظمى، والتي تحتوي على ميكروسومات، والحفاظ على بيليه. ثم, إضافة 2 ملليلتر من العازلة العازلة العزل الميتوكوندريا وإعادة تعليق بيليه بدقة عن طريق الأنابيب الخفيفة. الطرد المركزي هذا تعليق بيليه في 7، 000 XG وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل نابيرانت والحفاظ على بيليه الذي يحتوي على الميتوكوندريا الخام. إضافة 12 ملليلتر من 25٪ متوسطة الانحدار الكثافة لإعادة تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة. جعل تدرج كثافة متقطعة تحتوي على الميتوكوندريا الخام كما هو مبين في بروتوكول النص، والطرد المركزي في 52، 00 XG و4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة.
استخدام حقنة طويلة وحاد لجمع الميتوكوندريا المنقى في نطاق من واجهة بين 25 و 30٪ وسائط التدرج إلى واجهة بين 34 و 38٪ وسائط التدرج. نقل الميتوكوندريا المنقى إلى أنبوب نظيف. أضف عازل العزلة الميتوكوندرية إلى الميتوكوندريا التي تم جمعها لتخفيفه إلى وحدة تخزين ثلاثية.
جهاز طرد مركزي في 15، 00 XG و أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، والتخلص من فائقة. إضافة 2 ملليلتر من العازلة العازلة الميتوكوندريا لإعادة تعليق بيليه والطرد المركزي في 15، 000 XG وعند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تجاهل المابير والاحتفاظ بيليه.
جمع بيليه النهائي وتخزينها في 20 درجة مئوية. في هذه الدراسة، يتم إعداد عينات الميتوكوندريا عالية الجودة من سرطان المبيض البشري والأنسجة السيطرة على البروتيوميات الكمية على نطاق واسع. هناك بعض الاختلافات في إعداد الميتوكوندريا من أنسجة سرطان المبيض والسيطرة على أنسجة المبيض, بما في ذلك استخدام تدرج كثافة متقطعة مختلفة.
بعد الطرد المركزي، تم العثور على الميتوكوندريا المنقاة من أنسجة سرطان المبيض في واجهة بين 25٪ و 30٪، في حين أن تلك من السيطرة على أنسجة المبيض وجدت في مجموعة من الواجهة بين 25٪ و 30٪ إلى واجهة بين 34٪ و 38٪، ثم يتم تقييم نوعية الميتوكوندريا المعدة مع التفاضلية الطرد المركزي للسرعة والتدرج في المائة الكثافة عن طريق المجهر. تظهر صور المجهر الإلكتروني أنه في كل من سرطان المبيض والسيطرة على أنسجة المبيض، والعضيات الرئيسية المعزولة هي الميتوكوندريا، باستثناء كمية صغيرة من البيروكسيسومات. ومع ذلك، يُنظر إلى مورفولوجيا الميتوكوندريا على أنها تتغير في سرطانات المبيض أكثر من السيطرة على أنسجة المبيض.
كما يتم تقييم نوعية الميتوكوندريا المعدة عن طريق لطخة الغربية. تظهر صور البقعة الغربية أيضًا أن المكون الرئيسي في عينات الميتوكوندريا المعدة من سرطان المبيض والمبايض المُسيطر عليها هو الميتوكوندريا، باستثناء كمية صغيرة من البيروكسيسومات، وهو ما يتسق مع تحليل المجهر الإلكتروني. فمن المعقول أن يكون قد تم احتواء البيروكسيسومات في الميتوكوندريا المعدة، لأن الميتوكوندريا تتفاعل على نطاق واسع مع البيروكسيومات، والتي بدورها تعكس الاكتمال الوظيفي للميتوكوندريا.
وتبين هذه النتائج الجودة العالية لعينات الميتوكوندريا المعدة. عندما أقوم بهذا الإجراء، من المهم جداً أن تُرمِ أنسجة كاملة قبل التجانس، وأن تضيف التربسين إلى أنسجة التحكم المفرومة. من المهم أيضًا أن تقوم بإجراء أو إعداد تدرج الكثافة غير المتجاورة لعينات السرطان وعناصر التحكم.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء iTRAQ أو TMT البروتيوميات الكمية أو phosphoproteomics لتوضيح ملف تعريف البروتيوم سرطان المبيض، ويمكن إنشاء ملف تعريف فوسفوبروتومي لتوضيح أدوار الميتوكوندريا في سرطان المبيض في أعماق كبيرة. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة البروتيوم الميتوكوندريا بشكل منهجي والفوسفوبروتينيوم في سرطان المبيض ، وبناء نظام شبكة مسار الإشارات ، واكتشاف المؤشرات الحيوية الموثوقة والأهداف العلاجية.
