卵巢癌组织线粒体的制备与控制卵巢组织进行定量蛋白质组学分析

线粒体变化在人类卵巢癌中起着重要作用。该协议建立了一个有效的平台，从人类卵巢癌和控制组织分离和纯化线粒体，进行大规模蛋白质组学分析。线粒体，作为能量代谢、细胞信号和氧化应激的中心，对卵巢癌线粒体蛋白质组变化的洞察有助于我们理解分子机制，并且是有效生物标志物和治疗目标的发现。

该技术使用差速离心与密度梯度离心相结合，将线粒体与控制组织中人类卵巢癌分离，从而获得高质量的线粒体样本，用于定量蛋白质组学分析。线粒体制剂，加上 iTRAQ 定量蛋白质组学，已成功用于人类卵巢癌组织分析，这很容易转化为分析其他组织，线粒体蛋白质组学。那些从来没有执行过这种方法的人可能会发现，与癌症组织一样，将线粒体从卵巢控制中分离出可能很困难。

有必要添加 trypsin 来改善控制组织均质化，并添加额外的密度梯度介质层，以改善线粒体分离。要开始此过程，请准备 250 毫升的线粒体隔离缓冲器，如文本协议中所述。将大约 1.5 克卵巢癌组织放在干净的玻璃盘中。

加入两毫升预冷却线粒体分离缓冲液，轻轻清洗组织表面的血液。重复此洗涤三次。然后，使用干净的眼科剪刀将组织完全切碎成大约一立方毫米的碎片，然后将切碎的组织转移到50毫升的离心管中。

加入13.5毫升含有纳加塞的线粒体分离缓冲液，浓度为每毫升0.2毫克。使用电子均质器在四摄氏度下使切碎的组织均质两分钟。在此之后，再添加三毫升线粒体分离缓冲液到组织均质，通过移液混合。

将准备好的组织在1，300 xg下离心，在4摄氏度下离心10分钟。取出颗粒并保留上一液。接下来，将上一代在10000 xg和4摄氏度下离心10分钟。

取出含有微量的上一物质，并保留颗粒。加入2毫升线粒体隔离缓冲液，通过光移液彻底悬浮颗粒。在 7000 xg 和 4 摄氏度下将这种颗粒悬浮液离心 10 分钟。

丢弃上一提液，并保留含有粗线粒体的颗粒。加入12毫升25%密度梯度介质，重新悬浮提取的粗线粒体。如文本协议中所述，制作包含重新悬浮粗线粒体的不连续密度梯度，并在 52，000 xg 和 4 摄氏度下离心 90 分钟。

使用长而钝的注射器收集25%和30%梯度介质之间的界面上净化的线粒体，然后将其转移到干净的管子上。将线粒体隔离缓冲液添加到收集的线粒体中，将其稀释到三倍体积。在15，000 xg下离心，在4摄氏度下20分钟。

丢弃上一液，并保留颗粒。收集含有纯化线粒的最终颗粒，并将其储存在20摄氏度。首先，准备250毫升的线粒体隔离缓冲液，如文本协议中所述。

将大约 1.5 克的正常控制卵巢组织添加到干净的玻璃盘中。加入两毫升预冷却线粒体分离缓冲液，轻轻清洗组织表面的血液。重复此洗涤三次。

使用干净的眼科剪刀，将组织完全切碎成大约 1 立方毫米的碎片，然后将切碎的组织转移到干净的 50 毫升管中。将含有0.05%trypsin和20毫摩尔EDTA和PBS的溶液的8毫升加入到切碎的控制组织中，并在室温下消化30分钟，帮助细胞酶和释放线粒体。在200 xg下离心5分钟。

丢弃上一液，保留组织和细胞。加入13.5毫升含有纳加塞的线粒体分离缓冲液，浓度为每毫升0.2毫克，并使用电动均质器在4摄氏度下使切碎的组织均质两分钟。再将三毫升线粒体分离缓冲液加入组织均质，通过移液彻底混合。

在1，300 xg和4摄氏度下将准备好的组织均质离心10分钟。取出颗粒并保留上一液。将上一代在10000xg和4摄氏度下离心10分钟。

取出含有微体的上一液，并保留颗粒。然后，加入2毫升线粒体隔离缓冲液，通过轻移液彻底悬浮颗粒。在 7000 xg 和 4 摄氏度下将这种颗粒悬浮液离心 10 分钟。

丢弃上一提液，并保留含有粗线粒体的颗粒。加入12毫升25%密度梯度介质，重新悬浮提取的粗线粒体。如文本协议中所述，制作包含粗线粒体的不连续密度梯度，并在 52，000 xg 和 4 摄氏度下离心 90 分钟。

使用长而钝的注射器收集纯化线粒体，范围从 25 和 30% 梯度介质之间的接口到 34 和 38% 梯度介质之间的接口。将净化的线粒体转移到干净的管子中。将线粒体隔离缓冲液添加到收集的线粒体中，将其稀释到三倍体积。

在15，000 xg和4摄氏度下离心20分钟，然后丢弃上一代。加入2毫升线粒体分离缓冲液，在15，000 xg和4摄氏度下重新悬浮颗粒和离心机20分钟。丢弃上一液并保留颗粒。

收集最后的颗粒，并将其储存在20摄氏度。在这项研究中，从人类卵巢癌和控制组织中为大规模定量蛋白质组学准备了高质量的线粒体样本。在卵巢癌组织和控制卵巢组织进行线粒体的准备方面有一些差异，包括使用不同的不连续密度梯度。

离心后，从卵巢癌组织的纯化线粒体在25%至30%的界面发现，而来自对照卵巢组织的线粒体在25%至30%的界面到34%至38%之间的界面范围内，然后通过电子显微镜通过差速离心和密度梯度离心评估准备好的线粒体的质量。电子显微镜图像表明，在卵巢癌和控制卵巢组织中，分离的主要细胞器是线粒体，除了少量的过氧化物体。然而，线粒体的形态在卵巢癌中的变化比控制卵巢组织的变化要大。

准备好的线粒体的质量也通过西部印迹进行评估。西方的印迹图像还表明，从卵巢癌和控制卵巢中准备好的线粒体样本中的主要成分是线粒体，除了少量的过氧化物体，这与电子显微镜分析一致。将过氧化物包含在准备好的线粒体中是合理的，因为线粒体与过氧化物体广泛相互作用，这反过来又反映了线粒体的功能完整性。

这些结果表明，已准备好的线粒体样品具有高质量。当我执行这个程序时，重要的是，你完全切碎组织之前均质化，并添加三叶辛到切碎的控制组织。同样重要的是，您为癌症样本和控件制作和/或准备不连续密度梯度。

按照这个程序，iTRAQ或TMT定量蛋白质组或磷蛋白组可以执行，以澄清卵巢癌线粒体蛋白质组轮廓，和磷蛋白体配置文件可以建立，以澄清线粒体在卵巢癌在巨大深度的作用。该技术为研究人员系统地研究卵巢癌的线粒体蛋白质组和磷蛋白群，构建信号通路网络系统，发现可靠的生物标志物和治疗靶点铺平了道路。